Analyse von posttranslationalen Histonmodifizierungen und Chromatin-Effektorproteinen während Mitose und Apoptose

Desoxyribonuklerinsäure (DNA), die Erbinformation, definiert die
Struktur und Funktion jeder Zelle. In Eukaryoten ist sie um
Oktamere aus den Histonen H2A, H2B, H3 und H4 gewunden. Sie bilden
mit der DNA höhere Strukturen, das sog. Chromatin. Die Struktur des
Chromatins beeinflusst direkt die Aktivität der gebundenen DNA.
Eukaryoten besitzen daher viele molekulare Mechanismen zu ihrer
Veränderung, z.B. posttranslationale Modifizierungen (PTMs) von
Histonproteinen oder den Austausch von kanonischen Histonen mit
Histonvarianten (z.B. H3.1, H3.2, H3.3, u.a.). Für einige Varianten
sind ihnen eigene, charakteristische PTMs beschrieben, z.B. die
Phosphorylierung des Serins 31 der Variante H3.3 (H3.3S31ph). Die
Histone Code Hypothesis postuliert, dass PTMs von Histonen in
festen Mustern vorliegen können. Die Switch Hypothesis beschreibt
die Regulation von Bindemolekülen an Histone durch benachbarte
PTMs. Auf ihrer Grundlage wurde die These der Doppelmodifizierung
einer bekannten Trimethylierung der Aminosäure (AS) Lysin 79 mit
einer mutmaßlichen Phosphorylierung der AS Threonin 80 auf Histon
H3 aufgestellt (H3K79me3T80ph). Neben der Etablierung eines
einfachen Systems zur Identifizierung bisher unbeschriebener
Phosphorylierungen bestand ein zweites Ziel dieser Arbeit im
Nachweis der Phosphorylierung von H3 Threonin 80 in vivo. Eine
weitere Zielsetzung lag in der genaueren Charakterisierung der
bereits beschriebenen Varianten-spezifischen PTM H3.3S31ph, deren
Expression zwar eng umschrieben ist, über deren spezifische
Funktionen, Kinase und mögliche Effektorproteine aber wenig bekannt
ist. Um einen Überblick über Phosphorylierungen verschiedener
Histonroteine zu gewinnen, wurden unterschiedliche
Polyacrylamidgel-Elektrophoresen Verfahren (PAGE) etabliert. Zum
Einsatz kamen A/U-, T/A/U- und 2D-T/A/U-PAGE Verfahren. Sie
ermöglichten in Übereinstimmung mit der Literatur die Auftrennung
bekannter PTM und stehen nun für weiterführende Studien zur
Verfügung. Der massenspektrometrische Nachweis der putativen PTM
H3K79me3T80ph in vivo gelang nicht. Trotz optimierter
Versuchsbedingungen konnte die Phosphorylierung weder in der
MALDI-ToF, noch in der Orbitrap MS/MS nachgewiesen werden. Initiale
Antikörperdaten wurde aufgrund einer aufgedeckten Kreuzreaktivität
in Frage gestellt. Obgleich nicht mit letzter Sicherheit gesagt
werden kann, dass H3K79me3T80ph in vivo nicht existiert, wurde die
These letztlich verworfen. Die molekularbiologische Untersuchung
der Varianten-spezifischen PTM H3.3S31ph ergab bei verifizierter
Überexpression und Chromatin-Integration punktmutierter Histone
übereinstimmend Hinweise auf einen Effekt der PTM auf die
Zellteilung. Es konnte gezeigt werden, dass Serin 31 bzw. ihre PTM
H3.3S31ph sowohl Zellzyklus, als auch Wachstums- und
Proliferationsgeschwindigkeiten von HeLa Zellen beeinflusst. Dies
argumentiert für eine aktivierende Funktion von H3.3S31ph in der
Mitose. Weiter konnten mithilfe eines ELISAs fünf potentielle
Proteinkinasen für H3.3S31ph identifiziert werden. Vorrangig kommt
dabei die nukleäre Kinase PIM1 in Betracht. Zur weiteren
Untersuchung potentieller Effektorproteine wurde in vitro ein
molekularbiologisches Modellsystem etabliert. Es steht nun für
weiterführende Studien zur Verfügung. Erste Vorarbeiten konnten
bereits zeigen, dass hier evtl. Interaktionen mit dem Linkerhiston
H1 eine wichtige Rolle spielen.