Untersuchung zur Proteasomenhemmung des Mantelzelllymphoms mittels Bortezomib unter besonderer Berücksichtigung proteinanalytischer Verfahren

Das Mantelzelllymphom (MCL) ist eine neoplastische Erkrankung des
blutbildenden Systems, die durch die ektopische Expression des
Zellzyklus-regulierenden Proteins Cyclin D1 charakterisiert ist und
im Regelfall durch eine chromosomale Translokation
t(11;14)(q13;q32) ausgelöst wird. Trotz stetiger Verbesserungen der
Behandlungsmethoden, insbesondere der Optimierung der
Kombinationstherapie und dem Einsatz der
Anti-CD20-Antikörpertherapie- konnte bislang jedoch keine
wesentliche Verbesserung des Gesamtüberlebens erzielt werden. Die
Untersuchung der Wirksamkeit und der Wirkmechanismen neuer,
molekular ausgerichteter Therapieformen hat daher bei dieser
Erkrankung besonders große Bedeutung. Zu diesem Zweck wurde ein
2D-PAGE-basiertes Verfahren zur Analyse der zellulären
Proteinspiegel etabliert und durch die Charakterisierung der
Unterschiede zwischen zwei Non-Hodgkin-Lymphom (NHL)-Subtypen (MCL
und FL) auf Proteomebene validiert. Im Verlauf dieser Tests wurde
darüber hinaus die Aussagekraft der 2D-PAGE-Analyse durch die
Verwendung von „Proben-Pools“ verbessert, wodurch die Detektion
zufallsbedingter molekularer „Bystander“-Aberrationen unterdrückt
und ein repräsentativer molekularer Phänotyp charakterisiert werden
konnte. Die Zahl solcher unspezifischen Proteinpunkte, die nur in
einzelnen Zelllinien des Probenkollektivs nachgewiesen wurden,
konnten in den „Proben-Pools“ um >66% gesenkt werden. Im
Vergleich der zellulären Proteinspiegel der beiden NHL-Subtypen
wiesen 175 von insgesamt 1350 Punkte auf den 2D-PAGE-Gelen
Subtyp-spezifisch unterschiedliche Proteinspiegel auf, von denen 38
Punkte durch Massenspektrometrie (MS) identifiziert wurden. Die
identifizierten Kandidatenproteine können grob 7 funktionellen
Gruppen (Apoptose / Zelltod, Reparaturmechanismen, Zellzyklus und
Proliferation, Regulation der Transkription, grundlegende zelluläre
Funktionen, Tumor-Antigene, unbekannte Proteinfunktion /
hypothetische Proteine)zugeordnet werden und interagieren
vorwiegend in einem Netzwerk um den Tumorsuppressor p53. Das
Verfahren der 2D-PAGE-Analyse mit massenspektrometrischer (MS)
Proteinidentifizierung wurde anschließend benutzt, um die
molekulare Wirkung des Proteasomen-Inhibitors Bortezomib auf MCL
(Zelllinien und primäre Patientenzellen) zu analysieren. Dazu
wurden 5 MCL-Zelllinien (Granta519, HBL-2, Jeko-1, NCEB-1 und
Rec-1) einer Bortezomib-Konzentration von 25nM ausgesetzt und die
Veränderungen der zellulären Proteinspiegel nach 1h und 4h mit
denen von unbehandelten Zellen verglichen. In dieser Analyse waren
die Proteinspiegel von 148 der insgesamt 1013 in allen
MCL-Zelllinien nachweisbaren Proteinpunkten nach Bortezomib
signifikant verändert. Durch MS konnten 38 der 41 reproduzierbar
nachweisbaren Proteinpunkte identifiziert werden, wobei 20
ausschließlich in Bortezomib-sensitiven Zelllinien veränderte
Spiegel aufwiesen. Eine Western Blot-Analyse von 17 der 38
identifizierten Proteine bestätigte in 76% die in 2D-PAGE-Gelen
beobachteten Veränderungen der Proteinspiegel. Alle Zelllinien
zeigten veränderte Spiegel von verschiedenen Hitzeschockproteinen
(HSPA9, HSP7C, HSPA5, HSPD1), während Zelllinien die auf eine
Behandlung mit Bortezomib ansprachen, auch veränderte
Proteinspiegel bei Parametern des Energiestoff-wechsels (ATP5B,
AK5, TPI1, ENO2, ENO3, ALDOC, GAPDH), der RNA- und
Transkriptionsregulation (HNRPL, SFRS12) und der Zellteilung (NEBL,
ACTB, SMC1A, C20orf23) sowie der Tumorsuppressoren ENO-1 und FH
aufwiesen. Diese Proteine konnten in einem engen
Interaktionsnetzwerk um das wichtige zelluläre „Checkpoint“-Molekül
p53 gruppiert werden. Entsprechend konnten diese Ergebnisse in
primären MCL-Patientenproben bestätigt werden, was die Rolle dieser
Proteine im Rahmen der Proteasomeninhibition beim MCL
unterstreicht.