Antiangiogene Gentherapie mittels eines modifizierten AAV-Vektors

Bei der Tumorangiogenese ist die Balance zwischen den pro- und
antiangiogenen Faktoren zu Gunsten der proangiogenen Faktoren hin
verschoben. Therapeutisch lässt sich die Tumorangiogenese durch
eine Hemmung proangiogener Faktoren wie VEGF auch im klinischen
Setting wirksam beeinflussen. In präklinischen Modellen ließ sich
zeigen, dass auch durch Gabe von physiologisch vorkommenden
antiangiogenen Faktoren wie Endostatin und Angiostatin das Wachstum
experimenteller Tumoren signifikant gehemmt werden konnte.
Angiostatin besteht aus den ersten Kringel-Domänen des Plasminogens
und wird bei einer Reihe von physiologischen Prozessen im Körper
durch proteolytische Spaltung freigesetzt. Es inhibiert primäres
und metastatisches Tumorwachstum durch Hemmung der
Tumorneoangiogenese. Da diese löslichen Faktoren eine sehr kurze
Halbwertszeit aufweisen, ist eine Gabe als Protein wenig
erfolgversprechend und erste klinische Daten zur Applikation von
Endostatin als Protein in klinischen Studien waren enttäuschend.
Ein effizienter alternativer Applikationsweg für diese Faktoren
stellt zweifellos eine gentherapeutisch vermittelte systemische
Überexpression dar, wie sie beispielsweise bei Gerinnungsfaktoren
bereits in ersten klinischen Studien angewendet worden ist. Sowohl
die Leber als auch die Muskulatur können dabei als Orte der
Überexpression nach Gentransfer genutzt werden. Der Wahl und
Optimierung des Vektorsystems kommt bei einer solchen Strategie ein
zentraler Stellenwert zu. In der hier vorgelegten Arbeit wurde ein
Vektorsystem basierend auf Adeno-assoziierten Viren (AAV) für die
antiangiogene Gentherapie entwickelt und optimiert. Konventionelle
AAV-Vektoren basieren auf einem einzelsträngigen DNA Genom, welches
von infizierten Zellen zuerst in ein doppelsträngiges Genom
umgewandelt werden muss, um eine Genexpression zu ermöglichen.
Dieser Schritt ist limitierend auf dem Weg zur Transgenexpression.
In dieser Arbeit wurde ein sogennanter „self compementary“
AAV-Vektor (scAAV) hergestellt und charakterisiert, der in der
Zielzelle primär eine doppelsträngige DNA zur Verfügung stellt. Die
Strategie beruhte dabei auf Daten der Arbeitsgruppe von Prof. Dr.
J. Samulski, Capel Hill, USA. Es wurde auf dieser Basis ein
AAV-Konstrukt zur Expression des Green-Fluorescent Protein (GFP)
als Markergen und ein weiteres Konstrukt zur Expression von
Angiostatin kloniert und in einem AAV-Serotyp 2 verpackt. Das
scAAV-Vektorsystem zeigte in vitro eine um eine log-Stufe stärkere
Genexpression (GFP) als konventionelle AAV-Vektoren. Damit wurden
die Daten der amerikanischen Arbeitsgruppe bestätigt. In
funktionellen in-vitro-Experimenten zeigten sich die
scAAV/Angiostatin-Vektoren den konventionellen
AAV/Angiostatin-Vektoren signifikant überlegen bei der Hemmung der
Proliferation von Endothelzellen. In der Zusammenfassung konnte im
Rahmen dieser Arbeit der Grundstein gelegt werden für die Anwendung
von scAAV zur Expression von Angiostatin im Rahmen der Gentherapie
von Tumoren.