Molekularbiologische Charakterisierung des Membranankers des Yersinien-Adhaesins YadA

Nach wie vor spielen die von enteropathogene Yersinien
hervorgerufenen Erkrankungen eine wichtige Rolle im Bereich der
gesamten klinischen Medizin. Neben akuten Erkrankungen
(Yersiniosen), die vor allem bei Kleinkindern, alten und
abwehrgeschwächten Patienten vorkommen, sind es auch die
verschiedenen immunologischen Folgeerkrankungen, wie Arthritiden
oder das Reitersyndrom, die im besonderen Yersinia enterocolitica
in den Fokus des wissenschaftlichen Interesses rücken und eine
molekularbiologische Analyse der Infektionsmechanismen nötig
machen. Eine besondere Bedeutung kommt dem hochkonservierte
Virulenzplasmid pYV zu, das für ein TypIII- Proteinsekretionssystem
und für das Yersinien Adhäsin YadA (Autotransporter,
TypV-Sekretionssystem) kodiert. YadA ist der Prototyp einer Gruppe
von Autotransportern, deren struktureller Aufbau sich von allen
anderen bisher bekannten Autotransporterklassen unterscheidet, vor
allem im Bereich des Membranankers, des Teils also, der für den
Einbau des Proteins in die Membran, den Transport der funktionellen
Domäne durch die Membran, die Oligomerisierung und die Stabilität
des Gesamtproteins verantwortlich ist. Auf Grund dieser aus
molekularbiologischer Sicht zentralen Rolle, die der Membrananker
für das Funktionieren des Adhäsins und Autotransports von YadA
spielt, war es das Ziel der vorliegenden Arbeit mehr über die
Topologie und strukturellen Eigenschaften sowie des
Oligomerisierungs- und Transportmechanismus dieser C-terminalen
Domäne von YadA in Erfahrung zu bringen. Der Membrananker selbst
besteht aus vier C-terminalem ß-Faltblättern (Anker-Bereich) sowie
dem N-terminalem linker-Bereich, der Verbindung zur funktionellen
Passagierdomäne herstellt. In den linker-Bereich von N-terminal
verkürzten YadA-Mutanten wurden FLAG-Sondensequenzen einkloniert,
die mit speziell an diese FLAG-markierten Bereiche bindenden
monoklonalen Antikörper nachgewiesen werden können und so eine
Aussage über extrazelluläre oder intrazelluläre lokalisierte
Domänen möglich machen. Die Ergebnisse dieser Versuche legen nahe,
dass nahezu der gesamte linker-Bereich innerhalb der Membran, also
der vom Ankerbereich gebildeten transmembranösen Pore, befindet.
Weiterhin wurde versucht, mittels Cystein-Scanning-Mutagenese die
FLAG-Experimente zu bestätigen, was nicht gelang, weil die
eingefügten Cysteinreste in YadA nicht spezifisch mit
Biotinmalleimid reagierten. In einem weiteren Versuch wurde der
gesamte YadAMembrananker gegen Membrananker anderer Mitglieder der
Oca-Familie (UspA1 von Moraxella catarrhalis, EibA von Escherichia
coli, Hia von Haemophilus influenza)ausgetauscht. Es stellte sich
heraus, dass alle so hergestellten YadA-Hybridproteine exprimiert
und an der Bakterienoberfläche exponiert werden. Jedoch zeigten
sich Unterschiede bei der Funktionalität der Hybridadhäsine, vor
allem in der Serumresistenz, der Autoagglutination und der
Oligomerenstabilität. Die durchgeführten Untersuchungen bestätigen
das bestehende Modell des YadAMembranankers als Autotransporter und
unterstützen die Einteilung von YadA, EibA, UspA1 und Hia in eine
einheitliche Klasse von Autotransportern, die als Oca-Familie
bezeichnet wird. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die
N-terminale YadAPassagierdomäne von unterschiedlichen
Autotransporterdomänen über die äußere Bakterienmembran
transloziert wird.