Charakterisierung podosomaler Adhäsionsstrukturen in primären humanen Nabelschnurendothelzellen

Der Hauptregulator der vaskulären Homöostase ist das Endothel,
welches eine Vielzahl an vasoprotektiven Effekten ausübt. Die
Integrität und Regulation des endothelialen Zellayers der
Blutgefäße ist von großer Bedeutung bei physiologischen und
pathologischen Prozessen. Die Basis dieser Phänomene ist in der
dynamischen und exakt kontrollierten Regulation des Zytoskeletts
begründet. Die wichtigsten Regulatoren des Zytoskeletts stellen die
GTPasen der Rho-Familie und deren Effektoren dar. Im Rahmen dieser
Doktorarbeit untersuchten wir in primären humanen
Nabelschnurendothelzellen, eine neu in Erscheinung tretende
Zytoskelettstruktur, der wir in Anlehnung an ähnliche
Proteingruppierungen in monozytären Zellen den Namen
HUVEC-Podosomen gaben. HUVEC-Podosomen sind aufgrund ihrer
Komponenten mit klassischen Podosomen vergleichbar. Allerdings gibt
es zwischen beiden Strukturen auch Unterschiede, denn während
klassische Podosomen aus Ring und Kern bestehen, zeigen
HUVEC-Podosomen eine zweischichtige Architektur. Wie wir weiterhin
nachweisen konnten liegen Podosomen der Endothelzellen an der
ventralen Plasmamembran und haben engen Kontakt mit der
extrazellulären Matrix.. Somit fungieren sie, wie auch die
klassischen Podosomen, als Adhäsionsstrukturen. Sie dienen aber
nicht nur der Adhäsion, denn wie bei FITC-markierten
Monolayer-Versuchen gezeigt werden konnte, haben sie auch eine
proteolytische Aktivität, die insbesondere beim Matrixverdau und
der daran anschließenden Migration von Bedeutung ist. Ferner können
wir zeigen, daß HUVEC-Podosomen in ruhenden, konfluenten Zellayern
nicht beobachtet werden können. Sie lassen sich aber in
migratorischen (subkonfluent oder nach Verwundung) HUVEC, in hoher
Anzahl und diversen ringförmigen Formationen, vorwiegend in
Bereichen nahe dem Leitsaum nachweisen. Wie wir mit Hilfe von live
cell imaging-Experimenten zeigen konnten, sind diese Strukturen
hochdynamisch und breiten sich wellenartig mit einem weiten Radius
innerhalb einer Zelle aus. Scheinbar dispergieren diese Formationen
oder fusionieren mit der Zellplasma, wodurch sie die enthaltenen
Proteine für viele andere zytoplasmatische oder membranöse Prozesse
freigeben könnten. Durch Experimente, in denen Zytokine wie VEGF,
bzw. Zytokin-produzierende Zellen wie Monozyten den HUVEC-Kulturen
zugegeben wurden, konnten wir zeigen, daß diese die Bildung von
Podosomen induzieren und sogar erheblich steigern. Unsere Arbeiten
mit konstitutiv aktiven und dominant negativen GTPase-Mutanten
zeigten weiterhin, daß diese bei der Organisation und Entstehung
der HUVEC-Podosomen von entscheidender Bedeutung sind. Ferner
konnte mit Hilfe von Mikroinjektionsversuchen von einer Teildomäne
(A) des N-WASP-Proteins verifiziert werden, daß der Mechanismus zur
Bildung der HUVEC-Podosomen eine Arp2/3-abhängige Aktinnukleation
beinhaltet. Weiterhin ist die Bildung dieser Adhäsionsstrukturen
auch von Src Tyrosinkinasen und PI3-Kinase abhängig. Eine der
Komponenten von HUVEC-Podosomen ist das Markerprotein Drebrin.
Drebrin kann nur in diesen Strukturen und an Zell-Zell-Kontakten in
HUVEC detektiert werden. Mikroinjektionsversuche von diversen
Konstrukten der unterschiedlichen Regionen von Drebrin zeigen, daß
dieses Protein von großer Bedeutung für die Bildung und Struktur
der HUVEC-Podosomen ist. Die einzelnen
Protein-Protein-Interaktionen von podosomalen Komponenten
untereinander und mit Drebrin wurden mit Hilfe von
Immunpräzipitation getestet. Es ist uns jedoch nicht gelungen einen
Drebrin-Interaktionspartner zu finden. Eine Interaktion von Drebrin
konnten wir nur mit Drebrin selbst in Form einer Dimerisierung bzw.
mit F-Aktin nachgeweisen. Es ist sehr wahrscheinlich, daß es sich
bei HUVEC-Podosomen um ein multifunktionelles Organell handelt. Wie
wir in dieser Arbeit darstellen, sind HUVEC-Podosomen
Adhäsionsstrukturen. Sie können am häufigsten am Leitsaum
detektiert werden, wobei ihre Generierung nur in Zellen mit
migratorischen Phänotyp (in Zellen am Wundrand oder in
subkonfluenten layern) detektiert werden kann. Beide Tatsachen
sprechen dafür, daß HUVEC-Podosomen den Prozeß der Migration
unterstützen. Zudem können diese Adhäsionsstrukturen die Matrix
degradieren, wodurch sie so wiederum zur Migration aber auch
invasiven Prozessen beitragen könnten. HUVEC-Podosomen könnten auch
eine Funktion als Speicherform ihrer Komponenten ausüben. Sie
fusionieren mit der Zellmembran und liefern so möglicherweise
notwendige Proteine und Signale, die die Induktion von Protrusionen
ermöglichen und so migratorische Prozesse unterstützen könnten.
Durch die Involvierung u. a. von Drebrin, das an Zell-Grenzen
detektiert werden kann, können HUVEC-Podosomen möglicherweise einen
Einfluß auf Zell-Zell-Kontakte und Vorgänge wie Angiogenese
ausüben. Dies bestätigt auch die Tatsache, daß Zytokine die Anzahl
an Zellen erhöhen, die HUVEC-Podosomen generieren können und
Vorgänge wie Wundheilung beschleunigt ablaufen lassen und so u. U.
eine klinische Relevanz haben könnten.