Einfluss von oxLDL auf die Apoptoseinduktion und Zellkopplung über Gap Junctions

Vaskuläre Erkrankungen sind als Ursache für Mortalität und
Morbidität führend in westlichen Industrieländern. Es gibt
zunehmend Hinweise darauf, dass oxLDL eine herausragende Rolle bei
der Atheroskleroseinduktion bzw. -progression zukommt. Die initiale
Wirkung von im Blut zirkulierendem oxLDL findet auf der Ebene der
Interaktion mit dem vaskulären Endothel statt und resultiert in der
endothelialen Dysfunktion. Da die Zellfunktion durch die Integrität
der Endothelzellschicht bzw. deren interzelluläre Kommunikation
mitbestimmt ist, wäre es denkbar, dass für die oxLDL-induzierten
Veränderungen im Endothel u. a. die Beeinflussung der
Zell-Zell-Kommunikation via Gap Junctions eine Rolle spielt.
Bislang war jedoch wenig darüber bekannt, welchen Einfluss oxLDL
auf die interzelluläre Kommunikation über Gap Junctions in
Endothelzellen ausübt. Außerdem war es nicht geklärt, inwiefern
diese Veränderungen in der Zell-Zell-Kommunikation die Induktion
und den Schweregrad der oxLDL-induzierten Apoptose beeinflussen.
Ziele der Studie waren daher i) zu analysieren, ob und über welche
Mechanismen oxLDL einen Einfluss auf die interzelluläre
Kommunikation über Gap Junctions in Endothelzellen ausübt, ii) zu
untersuchen, welche Bedeutung der interzellulären Kommunikation
über Gap Junctions bzw. einzelnen Connexinen bei der Induktion der
Apoptose zukommt. Mittels der Dye-Transfer-Methode nach
Farbstoffinjektion in eine einzelne Zelle konnten wir zeigen, dass
oxLDL eine signifikante Steigerung der interzellulären
Kommunikation über Gap Junctions in HUVEC induziert. Dieser Effekt
ist dosisabhängig: er zeigte sich nur bei geringen
oxLDL-Konzentrationen (15 bzw. 26 μg/ml) und wurde bei weiterer
Erhöhung der Konzentration bis auf 100 μg/ml wiederum aufgehoben.
Die durch oxLDL verstärkte Zell-Zell-Kommunikation wurde in
Endothelzellen durch einen cAMP/PKA abhängigen Mechanismus
vermittelt, wobei die cAMP-Freisetzung durch ein
Cyclooxygenaseprodukt, wahrscheinlich Prostacyclin, getriggert
wurde. Mittels immunhistochemischer Färbungen für Cx37 und Cx43
konnten wir nicht bestätigen, dass die oxLDL-induzierte Verstärkung
der Zell-Zell-Kommunikation infolge einer Hochregulation der
Connexin-Expression auftritt. Im zweiten Teil der Studie wurde der
Einfluss von oxLDL auf die Apoptoseinduktion analysiert. Die
Apoptose wurde mittels der Annexin V - Propidium Iodid Färbung bzw.
durch Nachweis des Mitochondrienmembranpotentials
durchflusszytometrisch erfasst. OxLDL verursachte einen
signifikanten Anstieg der Apoptoserate in HUVEC. Zur Aufklärung der
Rolle bestimmter Connexine wurden weitere Experimenten in
Cx-transfizierten HeLa-Zellen durchgeführt. In diesen Zellen
erhöhen einzelne Connexine die Apoptoserate in unterschiedlichem
Ausmaß: Cx43 > Cx40 > Cx37. Um zu prüfen, ob die bloße
Anwesenheit der Connexine dafür von Bedeutung war oder ob von
Connexinen gebildete Gap Junctions dafür von Bedeutung waren,
wurden weitere Experimente durchgeführt. Dafür wurden in einem
neuen Versuchsansatz Zellen in Suspension (keine
Zell-Zell-Kontakte) sowie adhärente Zellen im Monolayer (bestehende
Zell-Zell- Kontakte) einer proapoptotischen Stimulation durch
Streptonigrin unterzogen. Die Zellen in Suspension wiesen erst zu
einem deutlich späteren Zeitpunkt apoptotische Veränderungen auf.
Das deutet auf eine Beteiligung der Gap Junctions bei der
Apoptoseinduktion hin. Diese Interpretation wurde durch Befunde
einer weiteren Versuchsreihe bestätigt. Bei Inkubation von
apoptotischen Cx43-positiven Zellen mit intakten Zellen wurde die
Apoptoserate der Letzteren nur dann signifikant erhöht, wenn diese
ebenfalls Connexin 43 exprimierten und funktionelle Gap Junctions
mit den bereits apoptotischen Zellen de novo bilden konnten. Somit
demonstriert diese Arbeit, dass Gap Junctions eine wichtige Rolle
bei der Apoptoseinduktion spielen. In nachfolgenden Studien soll in
Atherosklerose-Modellen überprüft werden, ob und inwiefern die hier
beschriebenen Mechanismen auch unter den In-Vivo-Bedingungen bei
den oxLDL-assoziierten Gefäß/Endothelschäden eine Rolle spielen.