Quantifizierung von minimaler Resterkrankung bei akuter myeloischer Leukämie mit NPM1 Mutation mittels Real-Time-PCR

Exon 12 Nucleophosmin (NPM1) Mutationen stellen die häufigsten
molekularen Aberrationen bei Erwachsenen mit akuter myeloischer
Leukämie (AML) dar. Molekulare Detektion der Mutation Typ A (NPM1
A), welche 80% aller NPM1 Mutationen ausmacht, könnte für die
Bestimmung von minimaler Resterkrankung (MRD) eingesetzt werden.
Der molekulardiagnostische Nachweis minimaler Resterkrankung
mittels RQ PCR ist von wesentlichem prognostischem Wert, um in
Zukunft eine möglichst präzise Abschätzung des individuellen
Rezidivrisikos, sowie eine risikoadaptierte Behandlung des
Patienten zu ermöglichen. In dieser Arbeit wurde ein RT PCR-Test
für die relative Quantifizierung von NPM1 Mutation A
Expressionslevels im Vergleich zu Genlevels des Housekeeping-Gens
ABL1 entwickelt. Die Expressionsratios wurden zusätzlich zur
Normalisierung über das Referenz-Gen ABL1 über das Expressionsratio
von NPM1 A zu ABL1 eines Calibrators normalisiert. Die PCR wurde
mithilfe der Zelllinie OCI/AML3, welche positiv für die NPM1 A
Mutation ist, etabliert. Der Calibrator entspricht einer Probe
OCI/AML3 cDNA. Mithilfe einer Verdünnungsreihe von OCI/AML3 cDNA
wurden getrennte Standardkurven für die Amplifikation von NPM1 und
ABL1 erstellt. Der Assay hat eine Sensitivität von 10-5, das heißt
die letzte nachweisbare Verdünnung von für die Mutation positive
cDNA ist 1:100 000. Die Spezifität der PCR konnte mit mehreren
Zelllinien, welche negativ für die NPM1 Mutation sind und keine
Amplifikation gezeigt haben, nachgewiesen werden. Die Ergebnisse
hinsichtlich Sensitivität und Spezifität konnten mit ausgewählten
Patientenproben bestätigt werden. Die klinische Anwendung wurde
mithilfe von Verlaufsmessungen von 51 NPM1 A positiven Patienten
durchgeführt. NPM1 A mRNA Expressionslevel wurden in 154
Knochenmark- und Blutproben zu unterschiedlichen Stadien der
Krankheit bestimmt. Bei 27 Patienten, die zum Zeitpunkt der
Diagnose und nach Induktionstherapie analysiert worden sind,
zeigten die NPM1 A Expressionsratios eine mittlere log10 Reduktion
von 2,48. Dieses Ergebnis korreliert mit dem Erfolg der Behandlung,
auch sichtbar in der Reduzierung der Blastenzahlen im Knochenmark.
Von den 51 Patienten die zur Diagnosestellung untersucht worden
sind, erlitten 21 ein Rezidiv. Zwei der 21 Patienten mit Rezidiv
verloren die NPM1 A Mutation im Rezidiv, was durch eine
Schmelzkurven-PCR bestätigt wurde. Die Beobachtung vom Verlust der
Mutation durch klonale Evolution bei 9,5% der untersuchten
Probenpaare von Diagnose und Rezidiv limitiert den Wert der NPM1
Mutation als molekularer Marker für MRD.