Optimierung der Sauerstoffversorgung in dreidimensionalen Zell-Leitschienen-Kulturen für das tissue engineering von Knochen

Zielsetzung und Fragestellung: Das Vorliegen knöcherner Defekte ist
ein wesentliches klinisches Problem in zahlreichen chirurgischen
Disziplinen. Das tissue engineering von Knochen stellt eine
innovative Methode dar, welche die Möglichkeit eröffnet, ein
Knochenersatzmaterial in theoretisch unbegrenzter Menge und
vorbestimmbarer Form bei minimaler oder fehlender
Hebedefektmorbidität zu gewinnen. Trotz dieses immensen Potenzials
konnte sich das tissue engineering in klinisch relevanten Ausmaßen
noch nicht durchsetzen. Ein wesentliches Problem wird in der bei
zunehmender Größe der Leitschienen inhomogenen Versorgung mit
Sauerstoff und Nährstoffen vermutet. Bisher konnte dies jedoch
quantitativ für das tissue engineering von Knochen nicht belegt
werden. Folglich fehlen auch Strategien zur Überwindung dieses
Problems nahezu gänzlich. Das Ziel der vorliegenden Untersuchung
bestand daher darin, die Sauerstoffkonzentration im Zentrum
besiedelter Leitschienen zunächst unter statischen Bedingungen zu
messen und zu überprüfen, ob es zu Auswirkung auf das Überleben der
Zellen kommt. Anschließend sollten die Bedingungen mit Hilfe eines
dynamischen Zellkultursystems optimiert und wiederum der Einfluss
auf die zentrale Sauerstoffkonzentration und das Zellüberleben
ermittelt werden. Material und Methoden: Zylindrische Leitschienen
aus demineralisierter boviner Matrix (DBM) mit einem Durchmesser
von 9 mm und einer Höhe von 5 mm wurden unter Verwendung einer
standardisierten Methodik mit 50.000 murinen präosteoblastären
Zellen (MC3T3) besiedelt und anschließend unter statischen und
dynamischen Bedingungen kultiviert. Unter statischen Bedingungen
erfolgte der Mediumwechel (Mem alpha) alle 48 Stunden, während
unter dynamischen Bedingungen eine kontinuierliche Mediumzufuhr mit
Hilfe einer Pumpe erfolgte. Als Standardperfusionsgeschwindigkeit
wurde 18 µl/min verwendet. Weitere Versuche erfolgten mit drei- (54
µl/min) und fünffacher (90 µl/min) Perfusionsgeschwindigkeit. Im
Untersuchungszeitraum von sieben Tagen wurde die
Sauerstoffkonzentration mit einer nadelartigen Sauerstoffsonde, die
definiert ins geometrische Zentrum der Leitschiene appliziert wurde
gemessen. Zusätzliche Messungen erfolgten unter statischen
Bedingungen im umgebenden Medium, unter dynamischen Bedingungen im
Mediumzu- und abfluss. Die Auswertung des Zellüberlebens und der
Zellproliferation erfolgte mit Hilfe eines live-dead-assays sowie
durch Zellzählung im Zentrum der Leitschiene. Ergebnisse: Unter
statischen Zellkulturbedingungen kommt es im Zentrum der mit 50.000
Zellen besiedelten Leitschienen zu einem dramatischen Abfall der
Sauerstoffkonzentration, wobei nach nur 5 Tagen die
Sauerstoffkonzentration bei 0 % liegt. Konsekutiv kann im
live-dead-assay ein ausgeprägtes Zellsterben, insbesondere im
Zentrum der Leitschienen nachgewiesen werden. Hier konnten nach
sieben Tagen keine überlebenden Zellen mehr beobachtet werden. Aus
den Sauerstoffmessungen im umgebenden Medium sowie den Ergebnissen
des live-dead-assay kann auf das Vorliegen eines deutlichen
Sauerstoffgradienten von der Oberfläche zum Zentrum der besiedelten
Leitschienen geschlossen werden. Diese Ergebnisse ließen sich bei
Besiedlung mit 50.000 humanen SCP-Zellen bestätigen. Unter
Verwendung dynamischer Zellkulturbedingungen konnte der Abfall der
zentralen Sauerstoffkonzentration deutlich vermindert und die
Fläche unter der Sauerstoffkurve (AUC) signifikant (p < 0,01)
vergrößert werden. Darüber hinaus konnte eine deutliche
Verbesserung des Zellüberlebens beobachtet werden, insbesondere
fielen signifikant (p < 0,01) mehr überlebende Zellen im Zentrum
der Leitschiene auf. Dennoch kommt es im Beobachtungszeitraum zu
einem deutlichen Abfall der Sauerstoffkonzentration im Zentrum der
Leitschiene. Durch eine Steigerung der Perfusionsgeschwindigkeit
auf das Drei- (54 µl/min) beziehungsweise Fünffache (90 µl/min)
konnte nochmals eine deutliche Verbesserung der
Sauerstoffversorgung und des Zellüberlebens, insbesondere in den
kritischen zentralen Arealen der Leitschiene, erreicht werden.
Schlussfolgerungen: Zentrale Hypoxie stellt einen wesentlichen
limitierenden Faktor für das Leitschienen-basierte tissue
engineering von Knochen in klinisch relevanten Dimensionen dar.
Daher sollte im Rahmen der Kultivierung von dreidimensionalen
Konstrukten ein adäquates Monitoring der Sauerstoffversorgung
gewährleistet sein. In der Optimierung der Sauerstoffversorgung
innerhalb von dreidimensionalen Konstrukten liegt ein
entscheidender Schlüssel für die Verbesserung der klinischen
Einsetzbarkeit des tissue engineering von Knochen.