Generierung muriner monoklonaler Antikörper und gentechnische Herstellung spezifischer Fab-Fragmente gegen die tumorassoziierte Isoform 1 des humanen Tenascin C für die Radioimmuntherapie von Gliomen
Beschreibung
vor 13 Jahren
Ein Problem bei der Behandlung von Gehirntumoren sind
Resttumorzellen, die am Rande des Tumors gesundes Hirngewebe
infiltrieren und operativ nicht entfernt werden können. Einen viel
versprechenden Ansatz für die Therapie maligner Gliome stellt die
lokale Applikation radioaktiv markierter monoklonaler Antikörper
bzw. Antikörper-Fragmente dar, die gegen tumorspezifische
Oberflächenmoleküle gerichtet sind. Ziel war es daher, monoklonale
Antikörper (mAk) und gentechnisch hergestellte Fab-Fragmente gegen
die tumorassoziierte Isoform 1 des humanen Tenascin C (hTNC-1) für
die Diagnostik bzw. die Radioimmuntherapie (RIT) von Gliomen zu
entwickeln. Die mAk wurden durch Immunisierung von Balb/c Mäusen
mit einer der alternativ gespleißten FNIII-Domänen, die für hTNC-1
spezifisch ist, generiert. Diese FNIII-Domäne wurde hierzu
gentechnisch hergestellt. Die Immortalisierung und klonale
Selektion der erfolgreich herangereiften murinen B-Lymphozyten
wurde, angelehnt an das von Kenett und Mitarbeitern entwickelte
Protokoll, durchgeführt (Kennett, et al., 1978). Der Antikörper
wurde aus den konditionierten Zellkulturmedien des entsprechenden
Hybridoma Zellklons mit geringem Aufwand aufgereinigt. Die
cDNA-Sequenzen der CH1- und der VH1-Domäne der H- und der L-Kette
des neu generierten mAk wurden hierfür in den bakteriellen
Expressionvektor pASK85-D1.3 kloniert und gentechnisch hergestellt.
Die Fab-Produktion in E. coli konnte so im Labormaßstab etabliert
werden. Nach in vitro Evaluation wurden die mAk und Fab-Fragmente
mit Indium-111-DTPA radiomarkiert und in U87MG-tragenden
SCID-Mäusen getestet. Der mAk mit der höchsten Avidität (WGGD4-B4)
wies eine spezifische Bindung mit hoher Affinität (KD ~ 35 nM ± 16
nM) an WHO°III und WHO°IV Gliome auf. Gesunde Hirnareale werden mit
diesem mAk nicht adressiert. Die an U87-MG-Tumoren tragende
SCID-Mäusen durchgeführten Untersuchungen zeigten für den mAk
WGGD4-B4 einen Anstieg der Aktivität im Tumor bis zu 72 h p.i., mit
mittleren Anreicherungen von 11% der ID/g Tumor. Anschließend
erfolgt eine langsame Dissoziation (~9% ID/g Tumor nach 120h p.i.).
Die Aktivität in den Referenzgeweben (z.B. Muskel) blieb zu jedem
gemessenen Zeitpunkt niedrig (Muskel
Resttumorzellen, die am Rande des Tumors gesundes Hirngewebe
infiltrieren und operativ nicht entfernt werden können. Einen viel
versprechenden Ansatz für die Therapie maligner Gliome stellt die
lokale Applikation radioaktiv markierter monoklonaler Antikörper
bzw. Antikörper-Fragmente dar, die gegen tumorspezifische
Oberflächenmoleküle gerichtet sind. Ziel war es daher, monoklonale
Antikörper (mAk) und gentechnisch hergestellte Fab-Fragmente gegen
die tumorassoziierte Isoform 1 des humanen Tenascin C (hTNC-1) für
die Diagnostik bzw. die Radioimmuntherapie (RIT) von Gliomen zu
entwickeln. Die mAk wurden durch Immunisierung von Balb/c Mäusen
mit einer der alternativ gespleißten FNIII-Domänen, die für hTNC-1
spezifisch ist, generiert. Diese FNIII-Domäne wurde hierzu
gentechnisch hergestellt. Die Immortalisierung und klonale
Selektion der erfolgreich herangereiften murinen B-Lymphozyten
wurde, angelehnt an das von Kenett und Mitarbeitern entwickelte
Protokoll, durchgeführt (Kennett, et al., 1978). Der Antikörper
wurde aus den konditionierten Zellkulturmedien des entsprechenden
Hybridoma Zellklons mit geringem Aufwand aufgereinigt. Die
cDNA-Sequenzen der CH1- und der VH1-Domäne der H- und der L-Kette
des neu generierten mAk wurden hierfür in den bakteriellen
Expressionvektor pASK85-D1.3 kloniert und gentechnisch hergestellt.
Die Fab-Produktion in E. coli konnte so im Labormaßstab etabliert
werden. Nach in vitro Evaluation wurden die mAk und Fab-Fragmente
mit Indium-111-DTPA radiomarkiert und in U87MG-tragenden
SCID-Mäusen getestet. Der mAk mit der höchsten Avidität (WGGD4-B4)
wies eine spezifische Bindung mit hoher Affinität (KD ~ 35 nM ± 16
nM) an WHO°III und WHO°IV Gliome auf. Gesunde Hirnareale werden mit
diesem mAk nicht adressiert. Die an U87-MG-Tumoren tragende
SCID-Mäusen durchgeführten Untersuchungen zeigten für den mAk
WGGD4-B4 einen Anstieg der Aktivität im Tumor bis zu 72 h p.i., mit
mittleren Anreicherungen von 11% der ID/g Tumor. Anschließend
erfolgt eine langsame Dissoziation (~9% ID/g Tumor nach 120h p.i.).
Die Aktivität in den Referenzgeweben (z.B. Muskel) blieb zu jedem
gemessenen Zeitpunkt niedrig (Muskel
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