Vergleichende Untersuchung zum Metabolismus von nano- und mikromolaren Konzentrationen des tabakspezifischen Nitrosamins NNK in humanen Leber- und Lungenmikrosomen
Beschreibung
vor 13 Jahren
Das Ziel dieser Arbeit war es, die konzentrationsabhängige
Metabolisierung des tabakspezifischen Nitrosamins
4-(Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanon (NNK) in den
Mikrosomen von Lunge und Leber des Menschen zu charakterisieren. Es
wurden kommerziell erhältliche gepoolte Mikrosomen verwendet um
vergleichbare Ergebnisse in den verschiedenen Ansätzen zu
erzielen. Die Mikrosomen wurden bei einer Proteinkonzentration von
0,2 mg/mL 20 min mit [5-3H]-NNK inkubiert. Zur Bestimmung der
Kinetik kamen je 16 Konzentrationen von 0,006 bis 499 µM zum
Einsatz. Die Charakterisierung des NNK-Metabolismus mit
spezifischen Hemmstoffen für Cytochrom P450 (CYP) Isoenzyme,
α-Naphthoflavon (NF; CYP 1A1/2), 8-Methoxypsoralen (MOP; CYP
2A6/13), Chlorzoxazon (CZ; CYP 2E1) und Troleandomycin (TAO; CYP
3A4/5) alleine und in Kombination aller 4 Stoffe, erfolgte bei 46
nM und 49 µM NNK und Hemmstoffkonzentrationen von 1, 5, 10, 25 und
50 µM. Der Einfluss von Nicotin und seines Hauptmetaboliten Cotinin
wurde bei den gleichen NNK-Konzentrationen mit einem 300- bzw.
3000-fachen Überschuss der Alkaloide geprüft. Art und Menge der
entstandenen Metaboliten wurde durch
Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit on-line
Radioaktivitätsdetektion ermittelt. Durch Einsatz eines neuen
Detektors mit vier hintereinander liegenden Messzellen und
integrierten Additionsverfahren gelang es die Nachweisgrenze
gegenüber handelsüblichen Detektoren um den Faktor 10 zu senken.
Die Zuordnung der Metaboliten erfolgte durch Co-Chromatographie von
Referenzsubstanzen, die durch UV-Detektion bei 245 nm bestimmt
wurden. In Humanlebermikrosomen wurden 5 NNK-Metaboliten
nachgewiesen, das Reduktionsprodukt
4-(Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanol (NNAL), die Produkte
der α-Methylenhydroxylierung von NNK und NNAL,
4-Oxo-4-(3-pyridyl)-butansäure (Ketosäure) und
4-Hydroxy-4-(3-pyridyl)-butansäure (Hydroxysäure), das Produkt
der α-Methylhydroxylierung von NNK,
4-Hydroxy-1-(3-pyridyl)-1-butanon (HPB) und das N-Oxidationsprodukt
von NNK, das NNK-N-Oxid. Humane Lungenmikrosomen bildeten die
gleichen Metaboliten außer HPB. Die Umsätze konnten für alle
Metaboliten über den gesamten Konzentrationsbereich von 6 nM bis
500 µM einer Reaktionskinetik nach Michaelis-Menten angepasst
werden. Bei Anpassung nur im niedrigen, nanomolaren Bereich ergaben
sich für alle Metaboliten außer Ketosäure und HPB km- und
Vmax-Werte, die um 2 bis 3 Größenordnungen niedriger lagen als die
Werte, die für den gesamten Konzentrationsbereich erhalten wurden.
Dabei änderte sich die katalytische Effizienz, der Quotient aus
Vmax/km-Werten nur geringfügig. Die Hemmstoffe wirkten in
Lebermikrosomen stärker als in Lungenmikrosomen. Bei keinem der
Hemmversuche konnte jedoch selbst unter Verwendung der höchsten
Konzentration eine vollständige Hemmung der NNK-Verstoffwechslung
durch α-Hydroxylierung und N-Oxidation erzielt werden. Die
CYP-Inhibitoren hatten erwartungsgemäß nur einen geringen Einfluss
auf die NNK-Reduktion zu NNAL. In der Leber wurde die HPB-Bildung
am stärksten gehemmt, gefolgt von der NNK-N-Oxidation, der Bildung
von Ketosäure und der Bildung von Hydroxysäure. In
Lungenmikrosomen war die Hemmung der NNK-N-Oxidation am stärksten
ausgeprägt. Die größten Unterschiede zwischen der nano- und der
mikromolaren NNK-Konzentration zeigte sich in Lebermikrosomen bei
Einsatz von NF mit mäßiger bis starker Hemmung aller
Stoffwechselwege bei 46 nM NNK und keiner Hemmung bis z.T. leichter
Steigerung des Metabolismus bei 49 µM NNK. Auffällige Unterschiede
auch bei TAO in Leber und Lunge und bei CZ in der Leber zeigen,
dass sich Versuche mit bisher verwendeten hohen NNK-Konzentrationen
nur bedingt auf niedrigere Konzentrationen übertragen lassen. Die
in früheren Untersuchungen gezeigte Hemmung des NNK-Stoffwechsels
konnte bei der mikromolaren NNK-Konzentration für die
α-Hydroxylierung von NNK in Lungen- und Lebermikrosomen bestätigt
werden. In der Leber wurde auch die NNK-N-Oxidation deutlich
gehemmt. Überraschend war die Hemmung der Reduktion von NNK zu
NNAL in Lungen- und Lebermikrosomen. All diese Effekte gingen bei
Einsatz der nanomolaren NNK-Konzentration verloren. Es ist deshalb
fraglich, ob unter realen Bedingungen bei Rauchern der
NNK-Stoffwechsel durch die Tabakalkaloide beeinflusst wird. Die
vorliegenden Untersuchungen zeigen, dass die bei Verwendung
unrealistisch hoher Konzentrationen von Fremdstoffen in vitro
erzielten Ergebnisse nicht ohne weiteres auf die tatsächliche
Belastungssituation des Menschen durch Umwelt, Nahrung und Genuss
von Tabakwaren zu übertragen sind.
Metabolisierung des tabakspezifischen Nitrosamins
4-(Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanon (NNK) in den
Mikrosomen von Lunge und Leber des Menschen zu charakterisieren. Es
wurden kommerziell erhältliche gepoolte Mikrosomen verwendet um
vergleichbare Ergebnisse in den verschiedenen Ansätzen zu
erzielen. Die Mikrosomen wurden bei einer Proteinkonzentration von
0,2 mg/mL 20 min mit [5-3H]-NNK inkubiert. Zur Bestimmung der
Kinetik kamen je 16 Konzentrationen von 0,006 bis 499 µM zum
Einsatz. Die Charakterisierung des NNK-Metabolismus mit
spezifischen Hemmstoffen für Cytochrom P450 (CYP) Isoenzyme,
α-Naphthoflavon (NF; CYP 1A1/2), 8-Methoxypsoralen (MOP; CYP
2A6/13), Chlorzoxazon (CZ; CYP 2E1) und Troleandomycin (TAO; CYP
3A4/5) alleine und in Kombination aller 4 Stoffe, erfolgte bei 46
nM und 49 µM NNK und Hemmstoffkonzentrationen von 1, 5, 10, 25 und
50 µM. Der Einfluss von Nicotin und seines Hauptmetaboliten Cotinin
wurde bei den gleichen NNK-Konzentrationen mit einem 300- bzw.
3000-fachen Überschuss der Alkaloide geprüft. Art und Menge der
entstandenen Metaboliten wurde durch
Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit on-line
Radioaktivitätsdetektion ermittelt. Durch Einsatz eines neuen
Detektors mit vier hintereinander liegenden Messzellen und
integrierten Additionsverfahren gelang es die Nachweisgrenze
gegenüber handelsüblichen Detektoren um den Faktor 10 zu senken.
Die Zuordnung der Metaboliten erfolgte durch Co-Chromatographie von
Referenzsubstanzen, die durch UV-Detektion bei 245 nm bestimmt
wurden. In Humanlebermikrosomen wurden 5 NNK-Metaboliten
nachgewiesen, das Reduktionsprodukt
4-(Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanol (NNAL), die Produkte
der α-Methylenhydroxylierung von NNK und NNAL,
4-Oxo-4-(3-pyridyl)-butansäure (Ketosäure) und
4-Hydroxy-4-(3-pyridyl)-butansäure (Hydroxysäure), das Produkt
der α-Methylhydroxylierung von NNK,
4-Hydroxy-1-(3-pyridyl)-1-butanon (HPB) und das N-Oxidationsprodukt
von NNK, das NNK-N-Oxid. Humane Lungenmikrosomen bildeten die
gleichen Metaboliten außer HPB. Die Umsätze konnten für alle
Metaboliten über den gesamten Konzentrationsbereich von 6 nM bis
500 µM einer Reaktionskinetik nach Michaelis-Menten angepasst
werden. Bei Anpassung nur im niedrigen, nanomolaren Bereich ergaben
sich für alle Metaboliten außer Ketosäure und HPB km- und
Vmax-Werte, die um 2 bis 3 Größenordnungen niedriger lagen als die
Werte, die für den gesamten Konzentrationsbereich erhalten wurden.
Dabei änderte sich die katalytische Effizienz, der Quotient aus
Vmax/km-Werten nur geringfügig. Die Hemmstoffe wirkten in
Lebermikrosomen stärker als in Lungenmikrosomen. Bei keinem der
Hemmversuche konnte jedoch selbst unter Verwendung der höchsten
Konzentration eine vollständige Hemmung der NNK-Verstoffwechslung
durch α-Hydroxylierung und N-Oxidation erzielt werden. Die
CYP-Inhibitoren hatten erwartungsgemäß nur einen geringen Einfluss
auf die NNK-Reduktion zu NNAL. In der Leber wurde die HPB-Bildung
am stärksten gehemmt, gefolgt von der NNK-N-Oxidation, der Bildung
von Ketosäure und der Bildung von Hydroxysäure. In
Lungenmikrosomen war die Hemmung der NNK-N-Oxidation am stärksten
ausgeprägt. Die größten Unterschiede zwischen der nano- und der
mikromolaren NNK-Konzentration zeigte sich in Lebermikrosomen bei
Einsatz von NF mit mäßiger bis starker Hemmung aller
Stoffwechselwege bei 46 nM NNK und keiner Hemmung bis z.T. leichter
Steigerung des Metabolismus bei 49 µM NNK. Auffällige Unterschiede
auch bei TAO in Leber und Lunge und bei CZ in der Leber zeigen,
dass sich Versuche mit bisher verwendeten hohen NNK-Konzentrationen
nur bedingt auf niedrigere Konzentrationen übertragen lassen. Die
in früheren Untersuchungen gezeigte Hemmung des NNK-Stoffwechsels
konnte bei der mikromolaren NNK-Konzentration für die
α-Hydroxylierung von NNK in Lungen- und Lebermikrosomen bestätigt
werden. In der Leber wurde auch die NNK-N-Oxidation deutlich
gehemmt. Überraschend war die Hemmung der Reduktion von NNK zu
NNAL in Lungen- und Lebermikrosomen. All diese Effekte gingen bei
Einsatz der nanomolaren NNK-Konzentration verloren. Es ist deshalb
fraglich, ob unter realen Bedingungen bei Rauchern der
NNK-Stoffwechsel durch die Tabakalkaloide beeinflusst wird. Die
vorliegenden Untersuchungen zeigen, dass die bei Verwendung
unrealistisch hoher Konzentrationen von Fremdstoffen in vitro
erzielten Ergebnisse nicht ohne weiteres auf die tatsächliche
Belastungssituation des Menschen durch Umwelt, Nahrung und Genuss
von Tabakwaren zu übertragen sind.
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