Herstellung und Charakterisierung monoklonaler Antikörper gegen sezernierte Moleküle des humanpathogenen Schimmelpilzes Aspergillus fumigatus

Aspergillus fumigatus ist der häufigste zum Tode führende
opportunistische Erreger invasiver Mykosen des Menschen. Durch den
zunehmenden Einsatz von Immunsuppressiva und agressiverer
Chemotherapieschemata, aber auch durch Zunahme von Organ- und
Stammzelltransplantationen, steigt die Zahl abwehrgeschwächter
Patienten stetig an und mit ihnen die Zahl der Invasiven
Aspergillosen. Bei steigender Inzidenz blieb die Letalität trotz
weiterentwickelten Therapiemöglichkeiten in den letzten Jahren
nahezu konstant. Einer der Hauptgründe dafür ist die meist späte
Diagnostik der Erkrankung, welche bei Entdeckung häufig so weit
fortgeschritten ist, dass jeder Therapieversuch zu spät kommt.
Diese Situation erfordert dringend die Einführung von neuen
diagnostischen Methoden zur Früherkennung der Invasiven
Aspergillose. Ein Ansatz in dieser Arbeit sollte sein,
herauszufinden welche Makromoleküle von A. fumigatus sezerniert,
und damit beim Patienten in den Blutkreislauf oder Urin gelangen.
Anschließend sollte untersucht werden, ob diese Pilz-Makromoleküle
auch unter Infektionsbedingungen im Menschen exprimiert werden und
letztendlich im Serum detektierbar sind. Dazu wurde A. fumigatus in
unterschiedlichen Medien kultiviert und sezernierte Proteine
analysiert. Pilzproteine sind für die Diagnostik so wichtig, da sie
als erregerspezifische Antigene mittels spezifischer Antikörper
nachgewiesen werden können. Umgekehrt können diese Antigene auch im
Patienten eine Antikörperantwort induzieren, die mittels Antigen
nachgewiesen werden kann. Von den elf sezernierten Proteinen, die
in dieser Arbeit identifiziert wurden, wurden zwei Proteine näher
charakterisiert: Die Protease Aspergillopepsin1 (PEP1) und das
Toxin Hämolysin (Hly). Gegen diese beiden Proteine wurden
monoklonale Antikörper (mAk) generiert, wofür Hly zuerst
rekombinant hergestellt werden musste. Mithilfe monoklonaler
Antikörper wurden sowohl die Sekretionsbedingungen von PEP1 und Hly
genauer charakterisiert als auch versucht, in Patientenserum diese
zwei Proteine nachzuweisen. Leider konnte weder PEP1 noch Hly im
Serum detektiert werden. Grund dafür könnte ein vorzeitig
stattgefundener Verdau durch serumeigene Proteasen sein, oder eine
zu geringe Konzentration der beiden Proteine im Serum. Die
Sensitivität dieses Test könnte verbessert werden, in dem diese
monoklonalen Antikörper z.B. innerhalb eines Sandwich-ELISAS
eingesetzt werden. Neben Proteinen haben sich in der Vergangenheit
auch Polysaccharide von A. fumigatus als geeignete diagnostische
Marker einer invasiven Aspergillose erwiesen. Zwar haben sie den
Nachteil, als Zellwandbestandteil von Pilzen nicht Aspergillus
spezifisch zu sein. Dagegen haben sie für den Nachweis im Serum
andere Vorteile: Sie sind sehr stabile Moleküle (z.B.
hitzebeständig) und werden in größeren Mengen von A. fumigatus
produziert und freigesetzt, sodass sie bereits mit weniger
sensitiven Methoden detektierbar sind. In dieser Arbeit wurden nach
Immunisierung zweier Mäuse mit A. fumigatus-Kulturüberstand u.a.
zwei Antikörper gegen Galaktofuranose (Galf) identifiziert.
Galaktofuranose kommt nicht nur als Seitenkette des Galaktomannans,
einem Hauptbaustein der Aspergillus-Zellwand, vor, sondern ist auch
Bestandteil vieler sezernierter Pilz-Glykoproteine. Das Vorkommen
sowohl als fester Bestandteil der Zellwand und gleichzeitig als in
die Umgebung abgegebenes Molekül macht den Zuckerrest
Galaktofuranose nicht nur zu einem brauchbaren Marker für
histopathologische Untersuchungen sondern auch für die Serologie.
Anhand einer Galf-Deletionsmutante von A. fumigatus konnte die
Spezifität zweier monoklonaler Antikörper (L-10-1 und L-99-13)
gezeigt werden. Diese Antikörper wurden im Folgenden genutzt, um
die Expressionsbedingungen von Galaktofuranose-Resten in A.
fumigatus näher zu untersuchen. Es fiel auf, dass die Freisetzung
von Zellwandbestandteilen mit Galaktofuranose-Resten stark von der
Zusammensetzung des Kulturmediums abhängig ist und erst mit
Auskeimung der Sporen einsetzt. Des weiteren sollte mit Hilfe der
beiden α-Galf-Antikörper versucht werden in Patientenserum
Galaktofuranose-Reste zudetektieren. Hierzu wurde ein
Sandwich-ELISA aufgebaut, der in zwei Varianten jeweils einen der
beiden α-Galf-Antikörper als Fänger-Ak nutzte und den mAk L-10-1
(nach Konjugation mit Peroxidase) als Detektor-Ak. Es konnte
gezeigt werden, dass dieser ELISA in Patientenseren sehr sensitiv
Galaktofuranose-haltige Bestandteile nachweist und damit die
Differentialdiagnostik einer invasiven Infektion durch A. fumigatus
verbessern könnte. Nach den in dieser Arbeit erhobenen Daten kann
die Sensitivität gegenüber dem kommerziell verfügbaren ELISA
vermutlich noch erhöht werden. Bezüglich der Spezifität konnten die
Probleme mit Galaktofuranose-Reste enthaltenen Antibiotika (wie
Augmentan) jedoch nicht beseitigt werden. Die guten Ergebnisse, die
in dieser Arbeit mit dem L-10-1-ELISA erzielt wurden, führten dazu,
dass dieser ELISA zur Zeit für den Einsatz in der Routinediagnostik
am Max-von-Pettenkofer-Institut validiert wird.