Entwicklung lentiviraler Vektoren für die B-zellspezifische Expression von Transgenen in vivo

Der Transfer von Genen ist eine unverzichtbare Methode für die
Erforschung von Genfunktionen in vivo, für die gezielte Expression
von Proteinen oder RNA-Molekülen, sowie für die Entwicklung von
Gentherapien z.B. gegen Krebserkrankungen oder genetische Defekte.
Gerade unter gentherapeutischen Gesichtspunkten sind virale
Gentransfervektoren von Interesse, mit deren Hilfe beispielsweise
fehlende bzw. eingeschränkte Genfunktionen wiederhergestellt werden
können. Ebenso vorstellbar ist der Einsatz viraler Vektoren für
Immunisierungen, die z.B. zur Auslösung tumorspezifischer
zellulärer Immunantworten führen. Wünschenswert ist in diesem
Zusammenhang besonders eine zellspezifische Expression von
Transgenen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden deshalb
lentivirale Vektoren entwickelt, mit deren Hilfe eine konstitutive
Genexpression in B-Zellen ermöglicht wurde. Die Beschränkung der
Genexpression auf B-Zellen wurde durch die Wahl eines
entsprechenden zellspezifischen Promotors gewährleistet.
Lentivirale Vektoren haben sich in jüngster Zeit zu interessanten
Werkzeugen für die Gentherapie sowie zu vielversprechenden
Vakzinkandidaten entwickelt. Mit Hilfe dieser Gentransfervektoren
können zahlreiche verschiedene Zelltypen, darunter auch
hämatopoetische Zellen einschließlich der Immunzellen, in vitro und
in vivo transduziert werden, wobei die Spezifität der
Antigenexpression auf der Wahl eines entsprechenden Promotors
beruht. Als Transgene wurden das verbesserte grün-fluoreszierende
Protein eGFP (enhanced green fluorescent protein; im Folgenden als
„GFP“ bezeichnet) und das Hühnerei-Albumin (im Folgenden als „OVA“
bezeichnet) exprimiert. Anhand umfangreicher Analysen der
GFP-Expression in Knochenmarkschimären konnte die B-Zellspezifität
der generierten Vektoren überprüft werden. Desweiteren wurden die
lentiviralen Vektoren auch systemisch (intravenös) angewandt. Hier
konnte gezeigt werden, dass die Spezifität der Genexpression mit
dieser Applikationsroute erhalten bleibt, wohingegen die
Expressionsstärke im Vergleich zu den Chimären erheblich
zurückgeht. Funktionelle Studien mit B-zellspezifischen,
OVA-kodierenden lentiviralen Vektoren konnten jedoch belegen, dass
die Expressionsstärke nach systemischer Anwendung noch ausreichend
war, um eine OVA-spezifische zelluläre Immunität zu stimulieren.
Damit erwies sich das System auch hinsichtlich möglicher
therapeutischer Anwendungen, z.B. als Vakzine, als funktionell.
Eine humorale Antikörperantwort gegen virale Hüllproteine bzw.
gegen OVA konnte nicht nachgewiesen werden. Zusammenfassend belegen
diese Daten, dass die systemische Anwendung B-zellspezifischer
lentiviraler Vektoren möglich ist und einen interessanten Ansatz
zur Generierung neuer Vakzine bieten kann. Denkbar wäre
beispielsweise eine Anwendung bei der Unterstützung therapeutischer
Vakzinierungen. Ein weiterer interessanter Aspekt in diesem
Zusammenhang ist die Rolle der B-Zelle als antigenpräsentierende
Zelle, die mit Hilfe einer temporären Kontrolle der Genexpression
genauer untersucht werden könnte. Aus diesem Grunde wurde im Rahmen
der vorliegenden Arbeit auch ein induzierbares gammaretrovirales
Genexpressionssystem entwickelt, um ein gezieltes An- und
Abschalten der Genexpression in B-Zellen zu erreichen. Die
Beschränkung auf B-Zellen wurde hier ebenfalls durch die Wahl eines
entsprechenden zellspezifischen Promotors gewährleistet.
Detaillierte in vivo-Analysen des Expressionssystems in
Knochenmarkschimären zeigten jedoch, dass es einerseits nach
Induktion nur zu einer schwachen Transgenexpression kam und es
andererseits eine unerwünschte Hintergrundexpression sowohl in
B-Zellen als auch in Nicht-B-Zellen gab. Aus diesen Gründen musste
von der Anwendung dieses Systems für geplante Studien zur Rolle der
Genexpression während verschiedener Stadien der B-Zellentwicklung
abgesehen werden.