Charakterisierung der Hybridsensorkinase LuxN und des Antwortregulators LuxO des Quorum sensing-Systems in Vibrio harveyi

Die Signaltransduktionskaskade des komplexen Quorum sensing-Systems
in Vibrio harveyi umfasst die drei Hybridsensorkinasen LuxN, LuxQ
und CqsS, das Histidinphosphotransferprotein LuxU und den
Antwortregulator LuxO. Bei niedriger Zelldichte funktionieren die
Hybridsensorkinasen als Autokinasen. Die Phosphorylgruppe wird
zunächst intramolekular übertragen und anschließend auf LuxU und
LuxO weitergeleitet. Phosphoryliertes LuxO aktiviert die Expression
von fünf regulatorischen RNAs, die im Zusammenspiel mit dem
RNA-Chaperon Hfq die Translation der mRNA des Masterregulators LuxR
inhibieren. Bei hoher Zelldichte wird die Kinaseaktivität der
Hybridsensorkinasen durch die jeweiligen Autoinduktoren (LuxN:
HAI-1, LuxQ: AI-2, CqsS: CAI-1) inhibiert, sodass es zum Abschalten
der Phosphorylierungskaskade und zur Anreicherung von LuxR kommt.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Proteine LuxN und LuxO
biochemisch näher charakterisiert. Mit Hilfe diverser Methoden
konnte die Topologie des Membranproteins LuxN, zusammen mit der
Lage des N-Terminus, gelöst werden: das Protein besteht aus neun
Transmembrandomänen mit einem periplasmatisch lokalisierten
N-Terminus. Im Zuge der biochemischen Charakterisierung von LuxN
wurden zwei an der Bindung des Autoinduktors HAI-1 beteiligte
Aminosäuren identifiziert. Das Membranprotein LuxN wurde
erfolgreich gereinigt und in Escherichia coli- und V.
harveyi-basierten Proteoliposomen rekonstituiert. Ebenso wurde der
in Form von Inclusion Bodies heterolog in E. coli überproduzierte
Antwortregulator LuxO gereinigt und renaturiert. Das renaturierte
Protein konnte erstmalig mit dem niedermolekularen Phosphodonor
[γ-32P]-Acetylphosphat markiert werden und eine Bindung an die DNA
in phosphorylierter und nicht-phosphorylierter Form im Bereich der
hypothetischen σ54- und LuxO-Bindestelle gezeigt werden.