Analyse membranständiger Subproteome aus Etioplasten und Chloroplasten der Gerste (Hordeum vulgare L.)

Etioplasten sind hochspezialisierte pflanzliche Organelle der
Plastidenfamilie, die während der Skotomorphogenese von Pflanzen
gebildet werden. Die Morphologie der Etioplasten unterscheidet sich
grundlegend von Chloroplasten, die während der Photomorphogenese
gebildet werden. Durch Belichtung von Pflanzen, die im Dunkeln
angezogen worden sind, kommt es zur Induktion der Transformation
von Etioplasten zu Chloroplasten. Die unmittelbar vor Induktion des
biologischen Systems bestehende Zusammensetzung der Proteine und
Proteinkomplexe des Etioplasten ist allerdings bislang kaum
untersucht worden. Im Rahmen dieser Arbeit erfolgten mehrere
spezifische Analysen von plastidären Subproteomen. Ausgewählte
Subproteome der inneren Membranen von Etioplasten der Gerste wurden
im Vergleich zum Proteom der Thylakoidmembran von Chloroplasten
analysiert. Durch die Kombination verschiedener
gelelektrophoretischer Trennmethoden für Einzelproteine und
Proteinkomplexe mit massenspektrometrischen Analysemethoden
gelangen sensitivste Nachweise niedrig konzentrierter
Untereinheiten von Membranproteinkomplexen. Darüber hinaus gelangen
der Nachweis niedermolekularer membranintegraler Proteine und die
spezifische Charakterisierung von Einzelproteinen. Im ersten Teil
der Arbeit wurden die N-Termini von
NADPH:Protochlorophyllid-Oxidoreduktase (POR) A und B durch ein
LC-MS basiertes Verfahren bestimmt. Es erfolgte die Entwicklung
einer Methode zur selektiven Isolation N-terminaler Peptide mittels
Höchstdruckflüssigkeitschromatographie (UPLC). Dazu wurden zwei
chemische Reaktionsschritte auf Protein- und Peptidebene
durchgeführt, wodurch das N-terminale Peptid nach einem tryptischen
Verdau ausschließlich acetyliert vorlag und interne Peptide durch
eine weitere Modifikation mit 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure
abgetrennt wurden. Dadurch konnte gezeigt werden, dass die
N-Termini von PORA und PORB homolog zueinander sind und eine
vergleichbare Erkennungssequenz für die prozessierende(n)
Protease(n) vorliegt. Das Transitpeptid von PORA ist somit deutlich
kürzer, als bislang vermutet, wodurch neue Rückschlüsse bezüglich
einer möglichen Bindestelle von Protochlorophyllid gezogen werden
konnten, da eine von Reinbothe et al. 2008 beschriebene Bindestelle
nicht im Bereich des Transitpeptids, sondern in Bereich der maturen
PORA liegt. Bei PORB konnten neben einem dominierenden N-terminalen
Peptid zwei weitere um jeweils ein Alanin verkürzte N-terminale
Peptide mit geringerer Signalintensität nachgewiesen werden. Dies
deutet auf eine unpräzise N-terminale Prozessierung hin. Im zweiten
Teil der Arbeit gelang die bislang umfassendste
massenspektrometrische Charakterisierung des
NAD(P)H-Dehydrogenase-Komplexes aus einer C3-Pflanze. In
Etioplasten konnten sechs plastidär kodierte und mindestens fünf
kernkodierte Untereinheiten des NDH-Komplexes identifiziert werden.
Dies gelang durch die Isolation des Komplexes mittels nativer PAGE
als 1. Dimension und die anschließende Aufkonzentrierung der
Untereinheiten in einer SDS-PAGE als konzentrierende 2. Dimension.
Dadurch konnte gezeigt werden, dass der NDH-Komplex bereits in
Etioplasten neben dem membranintegralen Subkomplex aus mindestens
zwei löslichen Subkomplexen aufgebaut ist. Aufgrund dieser
umfangreichen Assemblierung ist eine physiologische Funktion
wahrscheinlich und erste Versuche zur NAD(P)H-Dehydrogenase
Aktivität lieferten Hinweise auf eine mögliche enzymatische
Aktivität. Im dritten Teil der Arbeit gelang in Etioplasten
erstmals der Nachweis aller bekannten membranintegralen,
niedermolekularen Untereinheiten von Photosystem II, nicht aber von
Photosystem I. Die Untereinheiten von PSI konnten ausschließlich in
Chloroplasten nachgewiesen werden. Von PSII konnten 13
niedermolekulare Untereinheiten mit jeweils einer
Transmembrandomäne nachgewiesen werden. Diese Untereinheiten
konnten im Gegensatz zu Chloroplasten nicht in höhermolekularen
Komplexen, sondern ausschließlich nahe der Lauffront einer BN-PAGE
im Bereich der freien Proteine nachgewiesen werden. Der Nachweis
von PsbN war ausschließlich in Etioplasten möglich. Aus diesen
Ergebnissen wurde geschlossen, dass ausschließlich
nicht-chlorophyllbindende Untereinheiten von PSII in Etioplasten
akkumuliert werden und die Anreicherung von chlorophyllbindenden
Untereinheiten von PSI und PSII von der Anwesenheit von Chlorophyll
abhängt. Darüber hinaus konnten die vier niedermolekularen,
membranintegralen Untereinheiten des Cytochrom b6f-Komplexes in
Etioplasten und in Chloroplasten sowohl in der monomeren, als auch
dimeren Assemblierungsstufe nachgewiesen werden. Ermöglicht wurden
diese Nachweise durch eine neu entwickelte Methode zur Extraktion
von Proteinen aus einem Polyacrylamid-Gel mit organischen
Lösungsmitteln und der anschließenden massenspektrometrischen
Charakterisierung mittels offline ESI-MS.