Identifikation, Klonierung und retroviraler Transfer allorestringierter FMNL1-peptidspezifischer T-Zellrezeptoren für die Entwicklung adoptiver Immuntherapien gegen B-Zell-Non-Hodgkin-Lymphome

Die adoptive T-Zelltherapie ist eine attraktive Alternative zu
konventionellen Therapien zur Behandlung von malignen Erkrankungen.
So konnten bereits Tumorremissionen bei Melanompatienten nach
adoptivem T-Zelltransfer erreicht werden (Dudley et al, 2002b;
Morgan et al, 2006). Während im autologen System jedoch oft nur
unzureichende Antitumorantworten zu generieren sind, zeigt der
Erfolg der allogenen Stammzelltransplantation, dass im allogenen
System T-Zellen hoch effektiv Tumorzellen bekämpfen können. Die
allogene Stammzelltransplantation konnte auch bei
B-Zell-Non-Hodgkin-Lymphomen, wie beispielsweise der chronischen
lymphatischen Leukämie (CLL), mit Hilfe eines
Transplantat-gegen-Leukämie-Effektes (Graft-versus-Leukemia, GvL)
lang andauerndes, krankheitsfreies Überleben bewirken. Sie birgt
aber ein sehr hohes Morbiditäts- und Mortalitätsrisiko auf Grund
der Transplantat-gegen-Wirts-Erkrankung (Graft-versus-Host-Disease,
GvHD) in sich. Die im Transplantat enthaltenen T Zellen sind
hierbei sowohl für den erwünschten GvL-Effekt verantwortlich,
gleichzeitig aber auch für die unerwünschte GvHD (Horowitz et al,
1990; Kolb et al, 2004). Zur Minimierung des Risikos einer GvHD
könnten T Zellen eingesetzt werden, die spezifisch und
allorestringiert Peptide von tumorspezifischen Antigenen erkennen
und somit bevorzugt Tumorzellen angreifen. Die Reaktivität der T
Zellen kann durch einen T Zellrezeptor (TZR)-Transfer auf sekundäre
Zellen übertragen werden. Diese transgenen Zellen können dann
mittels adoptivem T Zelltransfer im Patienten zur selektiven
Bekämpfung von Tumorzellen zum Einsatz kommen. In Vorarbeiten wurde
FMNL1 (formin related protein in leukocytes 1) als hoch attraktives
tumorassoziiertes Antigen identifiziert, das in der chronischen
lymphatischen Leukämie (CLL) und in anderen Lymphomen, sowie in
Zelllinien solider Tumoren stark überexprimiert wird, während es in
gesunden Zellen fast ausschließlich in hämatopoetischen Zellen
vorkommt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, allorestringierte
FMNL1-peptidspezifische T-Zellen zu isolieren, zu charakterisieren
und den T-Zellrezeptor dieser T-Zellen in sekundäre Zellen zu
transduzieren. Hierzu wurden Peptide des tumorassoziierten Antigens
FMNL1 mit Hilfe von Prädiktionsalgorithmen vorhergesagt und in T
Zell-Stimulationsansätzen eingesetzt. Unter Einsatz von
HLA-A2-positiven T2-Zellen als antigenpräsentierende Zellen, die
mit dem prädizierten synthetischen Peptid FMNL1-PP2 beladen waren,
ist es gelungen allorestringierte, FMNL1-PP2-spezifische T Zellen
eines gesunden HLA-A2-negativen Spenders zu isolieren. Von 67
T-Zellklonen bzw. oligoklonalen T-Zellen konnte bei neun
T-Zellklonen Allorestriktion und FMNL1-PP2-Peptidspezifität
nachgewiesen werden. Der T-Zellklon SK22 war für diese neun
T-Zellklone, die auf Sequenzebene einen identischen T-Zellrezeptor
aufwiesen, repräsentativ. Der T-Zellklon SK22 zeigte in Reaktion
auf peptidbeladene T2-Zellen eine hohe Peptidspezifität für
FMNL1-PP2 im Kontext mit dem für SK22 allogenen HLA-A2. Nach
Zielzellerkennung sezernierte der T-Zellklon Zytokine wie IFNγ,
TNFα, GM-CSF und teilweise IL2. Der T Zellklon zeigte eine hohe
Aktivität und mittlere Avidität gegen FMNL1 PP2-beladene T2-Zellen.
Des Weiteren wurde die Reaktivität gegen unbeladene native Zellen
getestet. Der T-Zellklon SK22 erkannte verschiedene Zellen, wenn
sie HLA-A2-positiv waren und gleichzeitig FMNL1 exprimierten.
Hierzu zählten zum einen maligne Zellen, darunter verschiedene
Epstein-Barr-Virus (EBV)-positive und EBV-negative
Lymphomzelllinien und die Nierenzellkarzinomzelllinie RCC26, die
gut erkannt wurden sowie CD40-aktivierte CLL-Zellen, die schwächer
erkannt wurden. Bei der Untersuchung von gesundem Gewebe wurden
FMNL1-exprimierende HLA-A2-positive periphere Blutleukozyten (PBL)
schwach und B-Zellen in mittlerer Stärke erkannt. HLA-A2-positive
Zellen, die FMNL1 nicht exprimieren, wie beispielsweise
Lungenfibroblasten, wurden vom T-Zellklon SK22 nicht erkannt. Der T
Zellklon zeigte Kreuzreaktivität gegen neun verschiedene
lymphoblastoide Zelllinien (LCL), die Allelvarianten von HLA-A2
exprimierten. Zusätzlich wurden 4 von 18 HLA-A2-negativen
LCL-Zelllinien erkannt. Jeweils zwei dieser vom T Zellklon SK22
erkannten HLA-A2-negativen LCL-Zelllinien trugen ein gemeinsames
MHC-Klasse-I-Molekül. Eines davon war HLA-A*3303, welches durch die
Erkennung der HLA-A*3303-positiven Transfektante der C1R-Zelllinie
bestätigt werden konnte. Das andere war HLA-A*6802, welches zur
HLA-A2-Superfamilie gehört. Der T-Zellrezeptor des T-Zellklons SK22
wurde identifiziert, sequenziert und kloniert, sowie mit Hilfe von
Retroviren in sekundäre Zellen eingebracht. Durch den Transfer des
T Zellrezeptors von SK22 in sekundäre Zellen konnte nachgewiesen
werden, dass dieser T Zellrezeptor für die spezifische Reaktivität
des T-Zellklons SK22 verantwortlich war. Dies zeigte sich in der
T-Zellrezeptor-Oberflächenexpression nach Transduktion in
Jurkat76-CD8α-Zellen und in der Übertragung der Funktionalität des
T-Zellklons in PBL. Der T Zellrezeptor von SK22 ist ein „schwacher“
Rezeptor, da er in der Konkurrenzsituation mit einem weiteren
Rezeptor nur in geringem Grade an der Zelloberfläche von PBL
exprimiert wurde. Durch einen Austausch der jeweiligen konstanten
Regionen der T-Zellrezeptor-SK22-Sequenzen durch die konstanten
Bereiche eines murinen T-Zellrezeptors konnten in der Summe
verbesserte Expressionswerte in Jurkat76-Zellen und eine
verbesserte Funktionalität in PBL erreicht werden. Der T-Zellklon
SK22 zeigte Allorestriktion, FMNL1-PP2-Peptidspezifität und
Zytotoxizität gegen FMNL1-exprimierende Zellen, insbesondere gegen
Tumorzellen. Die beobachtete Kreuzreaktivität ist Fokus
weiterführender Untersuchungen. Im Fall des T-Zellrezeptors von
SK22 bedeutet es, dass Spender und Patienten sorgfältig nach
Analyse des gesamten MHC-Klasse-I-Expressionsmuster ausgewählt
werden müssen. Im Rahmen einer haploidentischen
Stammzelltransplantation ist jedoch der klinische Einsatz dieses
spezifischen T-Zellrezeptors zur Behandlung von
B-Zell-Non-Hodgkin-Lymphomen und anderen FMNL1-überexprimierenden
Tumorerkrankungen vielversprechend.