Der Wnt/ß-Catenin-Signaltransduktionsweg in humanen und murinen mesenchymalen Stammzellen

Mesenchymale Stammzellen (MSC) stellen aufgrund ihres
Differenzierungspotentials einen großen Hoffnungsträger in der
regenerativen Medizin dar. Entsprechend zahlreicher zell- und
tierexperi-menteller Untersuchungen scheint die klinische Anwendung
dieser adulten Stammzellpopulation im Rahmen einer Zelltherapie in
greifbare Nähe zu rücken, wobei MSC als Basis für einen
Patien-ten-spezifischen Zell- und Gewebeersatz dienen könnten. In
welcher Weise die regenerative Kapazität der MSC durch spezielle
Signaltransduktionsmechanismen gesteuert wird, ist jedoch noch
weitgehend unbekannt. Vor diesem Hintergrund wurde in der hier
vorliegenden Arbeit der Wnt/β-Catenin-Signaltrans-duktionsweg
sowohl in humanen (hMSC) als auch in murinen (mMSC) mesenchymalen
Stamm-zellen untersucht. Diesem komparativen Ansatz lag das Ziel
zugrunde, Gemeinsamkeiten und Unterschiede in diesen beiden
Zellentitäten zu evaluieren, um damit langfristig den Grundstein
für die Übertragbarkeit von Daten aus nachfolgend geplanten murinen
in vivo-Modellen auf die klinische Situation legen zu können.
Hierzu wurden zunächst die Basis-Komponenten des
Wnt/β-Catenin-Signalweges vergleichend analysiert. Eine Aktivierung
des Wnt-Signalweges wurde über Stimulation mit Wnt3a bzw. LiCl in
beiden Zellspezies sowie in einem RNA-Interferenz (RNAi)-basierten
Ansatz durch Knockdown der für den β-Catenin-Abbaukomplex
essentiellen Proteine APC und Axin2 in hMSC erreicht, während eine
Inhibtion durch die Transfektion von small interfering RNAs
(siRNAs) gegen das transkrip-tionsaktivierende Protein β-Catenin
bzw. den Wnt-Korezeptor LRP5 induziert wurde. Dabei zeigten sich
neben zahlreichen Gemeinsamkeiten unter anderem hinsichtlich der
Proliferation auch klare Unterschiede zwischen hMSC und mMSC. Dies
betraf insbesondere die Steuerung von Matrix-Metalloproteinase
(MMP)-mediierten Invasionsprozessen, die im Falle von hMSC eine
deutliche Wnt-Abhängigkeit aufwiesen, während die
Invasionsfähigkeit von mMSC nicht durch den Wnt-Signalweg reguliert
wurde. Diese Unterschiede in den zellulären Phänotypen spiegelten
sich vorwiegend in einer Spezies-divergenten Regulation der
Matrix-Metalloproteinase MT1-MMP wider, da nur in hMSC die
Aktivierung der Wnt-Signaltransduktionskaskade mit einer vermehrten
MT1-MMP-Expression einherging. Darüber hinaus konnte das
Tcf/Lef-Reporter-System in mMSC etabliert werden, das die
Quanti-fizierung β-Catenin-abhängiger Expression ermöglicht. Dies
erfolgt mit Hilfe eines Reporter-proteins, dessen Expression nur
nach Translokation von β-Catenin in den Zellkern induziert wird.
Mit diesem System konnte unter anderem auch der Nachweis der
funktionellen Plasmid-kodierten Wnt3a-Expression erbracht werden.
Derartig generierte Reporter-mMSC könnten vor allen Dingen
hinsichtlich einer Anwendung im in vivo-Mausmodell von großem
Vorteil sein, da Wnt-aktive MSC mittels eines in
vivo-Imaging-Systems visualisiert werden können, um ihre Rolle bei
Geweberegenerationsprozessen aufzuklären. In einem weiteren
Teilprojekt wurde die Wirkung von Dkk-1, einem Inhibitor des
kanonischen Wnt-Signalweges, in hMSC eingehend untersucht. Dabei
stand die Analyse der Wechselwirkungen zwischen Dkk-1 und seinem
Rezeptor LRP6 im Vordergrund. Versuche zum LRP6-Knockdown brachten
ein komplexes Regulationssystem zutage, das eine feinjustierte
Balance zwischen akti-vierenden und inhibierenden Signalen
impliziert. Die Ergebnisse zusätzlicher RNAi-basierter Experimente
wiesen außerdem auf eine funktionelle Divergenz von LRP5 und LRP6
hin. So vermittelt der Wnt-Korezeptor LRP5 vornehmlich aktivierende
Signale, wie sie z.B. durch Wnt3a ausgelöst werden, während LRP6
hauptsächlich eine repressive Funktion beispielsweise durch Bindung
von Dkk-1 zuzuordnen ist. Da neben den LRP-Rezeptoren auch
Frizzled-Rezeptoren (Fzd) eine wesentliche Rolle bei der
Wnt-Signalerfassung spielen, wurde zunächst das
Fzd-Expressionsprofil in hMSC und mMSC mittels semiquantitativer
RT-PCR-Analysen näher untersucht. Dabei zeigte sich, dass alle
bisher bekannten 10 Fzds auch in MSC exprimiert werden, dieses
jedoch in unterschiedlichem Ausmaß. Zudem ergaben
Wnt3a-Stimulationsexperimente in hMSC, dass die Expression von Fzd8
negativ durch Wnt3a beeinflusst wird. Um die Bedeutung von Fzd8
näher zu evaluieren, wurden daher Fzd8-Knockdown-Experimente
durchgeführt. Diese ließen erkennen, dass die hMSC-Proliferation
maß-geblich von der Fzd8-Expression abhängt, wobei allerdings Fzd8
keinen direkten Rezeptor für Wnt3a darstellt. Zusammenfassend
spiegeln die in der vorliegenden Promotionsarbeit erhobenen Daten
zum Teil eindeutige Unterschiede zwischen basalen Wnt-regulierten
Prozessen in hMSC und mMSC wider, denen insbesondere bei der
präklinischen Validierung von therapeutischen Strategien in
Maus-modellen eine tragende Rolle zukommt. Da der
Wnt/β-Catenin-Signalweg maßgeblich an der Steuerung des invasiven
Verhaltens von hMSC beteiligt ist, wie dies in ähnlicher Weise von
anderen Forschergruppen auch für die Metastasierung von Tumorzellen
nachgewiesen werden konnte, erscheint es zukünftig von vorrangigem
Interesse, die hier erhobenen in vitro-Daten in einem in
vivo-Mausmodell zu evaluieren. In diesem Kontext kann allerdings
nur durch einen komparativen Ansatz, wie er dieser Arbeit zugrunde
liegt, die Basis für ein Spezies-relevantes drug design bezüglich
des Wnt-Signalweges entwickelt werden, um schließlich
aussagekräftige Stamm-zelltherapien bzw. Anti-Tumorstrategien
entwickeln zu können.