Entwicklung der Array-CGH zur hochauflösenden, genomweiten Untersuchung von DNA-Veränderungen einzelner Tumorzellen

Trotz erfolgreicher Resektion des Primärtumors sterben bis heute
ca. 40% aller Brustkrebspatientinnen an den Folgen der
Metastasierung. Inzwischen ist zunehmend anerkannt, dass wenige
selektierte Tumorzellen für die Progression der Erkrankung und eine
Therapie-Resistenz verantwortlich sind. Es ist deshalb fraglich, ob
genomische Veränderungen, die zur Disseminierung führen, entdeckt
werden können, wenn die Masse der Zellen eines heterogenen
Primärtumors untersucht wird. Einzelne Tumorzellen disseminieren in
ektope Organe, wie das Knochenmark, und gelten als die Vorläufer
der metachronen Metastasen. Eine genetische Analyse dieser Zellen
könnte zur Entdeckung neuer Zielstrukturen für adjuvante Therapien
führen. Um genomweit und hochauflösend genomische Aberrationen
identifizieren zu können, wurde im Rahmen der vorliegenden
Dissertation ein Protokoll entwickelt, das Array-CGH-Analysen von
einzelnen Zellen ermöglicht. Hierfür war es notwendig ein Verfahren
zur Aufreinigung und Amplifikation von BAC-DNA zu entwickeln, die
Bedingungen zur Array-Herstellung zu optimieren und ein
Hybridisierungsprotokoll zu etablieren. Der daraufhin hergestellte,
3000 BAC-Klone umfassende 3K BAC-Array mit einer mittleren
Auflösung von 1 Mb war bei der Analyse amplifizierter DNA aus
Einzelzellen konventionellen BAC- und Oligonukleotid-Arrays
überlegen. Bei Hybridisierungen von Einzelzell-DNA mit bekanntem
Karyotyp wurde bei normalen Zellen ein balanciertes Profil, bei
Einzelzell-DNA eines Patienten mit Trisomie 21 die zusätzliche
Kopie des Chromosoms 21 und bei Einzelzell-DNA von T47D-Zellen der
komplexe Karyotyp in Übereinstimmung mit der Literatur dargestellt.
Zusätzlich wurden Kriterien zur Auswahl zuverlässig
hybridisierender BAC-Klone identifiziert und ein Assay zur
Vorhersage einer erfolgreichen Array-CGH Analyse von
Einzelzell-Amplifikaten entwickelt. Bei der Untersuchung einzelner
disseminierter Tumorzellen aus dem Knochenmark von
Brustkrebspatientinnen wurden sowohl große Alterationen, die durch
Metaphasen-CGH detektiert worden waren, als auch kleine zusätzliche
Aberrationen zwischen 3,5 und 4,7 Mb Größe detektiert. Ausgewählte
chromosomale Gewinne konnten durch eine qPCR unabhängig verifiziert
werden. Der 3K BAC-Array erhöht die Auflösung der Metaphasen-CGH um
den Faktor 10-30 und ist außerdem publizierten Verfahren zur
Array-CGH mit Einzelzellen überlegen. Mit seiner Hilfe war eine
hochauflösende Untersuchung gestreuter Methaphasen-CGH-negativer
Tumorzellen möglich, was zur Identifizierung bislang unerkannter
Veränderungen führte. Die Einzelzell-Array-CGH-Technologie
ermöglicht nun die Charakterisierung mikrometastatischer
Vorläuferzellen und damit neue Erkenntnisse über frühe Stadien der
Krebserkrankung.