Regulation des Säure-induzierten Cad-Systems von Escherichia coli durch den membranintegrierten Transkriptionsaktivator CadC und die Lysin-spezifische Permease LysP

Das Cad-System von E. coli gehört zu den Säure-induzierbaren
Aminosäure-Decarboxylase-Systemen und spielt eine wichtige Rolle
bei der Säureschutzantwort. In diesem System erfolgt die
Reizwahr-nehmung, Signaltranslokation über die Membran und
Transkriptionsregulation durch ein einziges Protein, nämlich CadC.
In Gegenwart von induzierenden Bedingungen (niedriger pH-Wert und
Lysin) aktiviert CadC die Expression des cadBA-Operons, dadurch
kommt es zur Decarboxylierung von Lysin zu Cadaverin und CO2 durch
die Lysin-Decarboxylase CadA und zum Export von Cadaverin durch den
Lysin/ Cadaverin-Antiporter CadB. Dabei werden Protonen aus dem
Cytoplasma entfernt und der extrazelluläre pH-Wert durch das
basische Cadaverin erhöht. Das Lysin-Transportprotein LysP
inhibiert die cadBA-Expression bei nicht-induzierenden Bedingungen,
das bei der Decarboxylierung gebildete Cadaverin übt einen
negativen Rückkopplungseffekt auf die Expression von cadBA aus. Im
Rahmen der vorgelegten Arbeit wurden die Regulation des Cad-Systems
durch CadC und die Lysin-spezifische Permease LysP, die
Reizwahrnehmung durch CadC und die Struktur von CadC untersucht.
Mittels Transkriptions- und Translationsanalysen wurde das Cad-
System u. a. in E. coli MG1655 (Wildtyp) und E. coli MG1655-lysP211
(lysP-negativ) untersucht. Die cadBA- Expression war in E. coli
MG1655-lysP211 deutlich höher als im Wildtyp, als Folge dessen war
auch die relative Menge an CadA und die Konzentration an
extrazellulärem Cadaverin erhöht. Des Weiteren war in dieser
Mutante durch den Wegfall des Repressors LysP der Bedarf an
extrazellulärem Lysin als Induktor der cadBA-Expression vollständig
eliminiert. In Zusammenarbeit mit dem Institut für Theoretische
Physik der Universität zu Köln wurde anhand der für E. coli MG1655
(Wildtyp) gemessenen Daten ein mathematisches Modell erstellt und
mit Hilfe dieser Daten die Dynamik des Cad-Systems in E. coli
MG1655-lysP211 berechnet. Die in vivo bestimmten Ergebnisse wurden
durch die in silico erhaltenen Daten sehr gut wiedergegeben. In der
vorliegenden Arbeit konnte auch gezeigt werden, dass CadC kein
Sensor für Lysin ist. In vitro Experimente (ITC-Messungen,
Tryptophanfluoreszenz-Messungen) ergaben, dass CadC nur eine extrem
niedrige Affinität für Lysin aufweist, in vivo war ein bestimmter
Schwellenwert für die Induktion der cadBA-Expression nötig,
ansonsten hatte die Lysin- Konzentration keinen Einfluss. Da Lysin
somit nicht durch CadC wahrgenommen wird und deshalb die
Interaktion zwischen CadC und dem Transportprotein LysP nicht über
die Konkurrenz beider Proteine um das Substrat Lysin erfolgt,
beruht die Lysin-Abhängigkeit der cadBA-Expression vermutlich auf
einer direkten Interaktion zwischen CadC und LysP. In vitro konnten
CadC und LysP in Proteoliposomen quervernetzt werden, dies
indizierte eine Affinität beider Proteine zueinander. Das
Vorhandensein von Lysin löst die Interaktion zwischen CadC und LysP
auf und ist somit ein wichtiger Schritt für die Aktivierung von
CadC. Durch Messungen der intrinsischen Tryptophanfluoreszenz mit
der periplasmatischen Domäne von CadC (CadC188-512) konnte gezeigt
werden, dass diese eine Affinität für den Inhibitor Cadaverin
aufweist, der KD-Wert hierfür betrug 96 µM. In vivo Experimente
bestätigten, dass das Vorhandensein der periplasmatischen Domäne
für die Hemmung der cadBA-Expression durch Cadaverin essentiell
ist. Somit scheint die Inhibierung der cadBA-Expression durch
Cadaverin über eine direkte Interaktion mit der periplasmatischen
Domäne von CadC zu erfolgen In Zusammenarbeit mit dem Lehrstuhl für
Biologische Chemie der Technischen Universität München wurden
Strukturuntersuchungen zu CadC188-512 und CadC mittels
3D-Kristallisation durchgeführt. CadC188-512 konnte sehr gut
überproduziert und gereinigt werden, und es entstanden bereits
Kristalle, von denen einer am Synchrotron vermessen werden konnte.
Die Auflösung (2,5 Å) war jedoch für eine Strukturaufklärung noch
zu gering. In der periplasmatischen Domäne von CadC befinden sich
zwei Cysteinreste. Mit Hilfe von in vitro Experimenten konnte die
Ausbildung einer Disulfidbrücke in CadC188-512 bestätigt werden.
Durch die Reduktion der Disulfidbrücke war die Affinität für den
Ligand Cadaverin geringfügig vermindert. Das Auflösen der
Disulfidbrücke könnte ein wichtiger Mechanismus für die Aktivierung
von CadC darstellen. Wurde die Ausbildung einer Disulfidbrücke
durch die Substitution der Cysteinreste durch Alanin verhindert, so
wurde die cadBA-Expression in vivo Lysin-unabhängig aktiviert.
Möglicherweise repräsentieren diese CadC-Derivate ein
„semi-aktives“ CadC, das für eine volle Aktivierung nur noch einen
Reiz benötigt.