Entwicklung neuer Methoden zur massenspektrometrischen Charakterisierung von Membranproteinen

Etwa 30% aller Gene codieren für Membranproteine (MP). Trotz ihrer
hohen Relevanz, speziell im medizinischen Bereich, stellt die
Analyse von MP aufgrund ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften
ein häufiges Problem in der Proteinbiochemie dar. Diese Arbeit soll
eine Einsicht in die Problematik geben sowie Lösungsansätze
aufzeigen, um den Umgang mit diesen Polypeptiden zu vereinfachen.
Ein geeignetes Modellsystem zum Studium der Eigenschaften
membranintegraler Proteine und Peptide sowie zur Verbesserung der
bestehenden Analysemethoden stellte die Thylakoidmembran der
Plastide dar. Um das funktionelle Proteom der Thylakoidmembran zu
definieren, wurden die Proteinkomplexe der Thylakoidmembran von
Gerste (Hordeum vulgare) über hochauflösende 2D-Blue Native
/SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) getrennt. Das Gelsystem
erlaubte die Isolation der photosynthetisch aktiven Proteinkomplexe
PSI/LHCI, PSII, LHCII, Cytochrom b6/f und ATPase in
unterschiedlichen Assemblierungszuständen. Im Fokus der
Untersuchungen stand die Charakterisierung der isolierten
Subkomplexe von PSII. Die Identifikation der Komplexuntereinheiten
erfolgte nach enzymatischem In-Gel Verdau und
massenspektrometrischer Analyse der entstandenen Peptide (offline
nanoESI-MSMS). MP > 10 kDa wurden ausschließlich über Peptide
aus den löslichen Abschnitten identifiziert. Die Analyse der
niedermolekularen Untereinheiten (< 10 kDa) wurde auf Ebene des
Gesamtproteins nach Extraktion aus den Komplexbanden der BN-PAGE
realisiert. Dabei konnten dem mono- und dimeren PSII-Subkomplex
folgende niedermolekularen UEn zugeordnet werden: PsbE, PsbF, PsbI,
PsbK, PsbL, PsbM, PsbTc und PsbX. Da kein Unterschied in der
Zusammensetzung des mono- und dimeren PSII-Subkomplexes existierte,
konnte eine Beteiligung einer der niedermolekularen UEn an der
Ausbildung des dimeren PSII-Subkomplexes im Rahmen der
Assemblierung nicht bestätigt werden. Die Lichtsammelproteine
(LHCP) des LHCII wurden nach 2D BN/SDS-PAGE auf Ebene der
Superkomplexe oder abgetrennt als Mono- und Trimerer
LHCII-Subkomplex identifiziert, wobei das Trimer durch das Fehlen
der minoren LHCP (CP29, CP26 und CP24) charakterisiert war. Die für
Membranproteine der Thylakoide ungewöhnlich hydrophilen LHCP
erhielten die benötigte Hydrophobizität zur Durchspannung der
Membran über die Bindung von Pigmenten (Chlorophyll). Eine
eindeutige Unterscheidung der Genprodukte von Lhcb1-3 war trotz
extremer Sequenzhomologie über die Detektion eines
charakteristischen Peptids im N-terminalen Bereich der maturen
Sequenz möglich. In Gerste wurde somit jeweils eine Form von Lhcb2
und 3, sowie sechs Isoformen von Lhcb1 identifiziert. Um den In-Gel
Verdau von Proteinen nach elektrophoretischer Trennung zu
vereinfachen und zu standardisieren, wurde ein Reaktionsgefäß
(OMX-S) aus Polypropylen entwickelt. Im Zuge der Anpassung des
konventionellen Protokolls zum In-Gel Verdau von Proteinen für
OMX-S wurde ein optimiertes Verdauprotokoll entwickelt, das ohne
die Reaktionsschritte Entfärbung, Reduktion & Alkylierung der
AS Cystein sowie eine multiple Extraktion zur Anreicherung der
entstandenen Peptide auskommt. Die Erhöhung der Reaktionstemperatur
auf 50°C und die Verkürzung der Diffusionsstrecke für die Protease
erhöhten zudem die Effizienz des Verdaus und führten zu einer
Reduktion der gesamten Prozesszeit von 6-24 h auf 1 h. Welche
Auswirkung die Auslassung einzelner Reaktionsschritte auf die
Peptidausbeute hatte, wurde nach differentieller Isotopenmarkierung
der generierten Peptide mittels massenspektrometrischer Analyse
quantifiziert. Da jeder Prozessierungsschritt eine potentielle
Quelle für Verluste darstellte, waren die Peptidausbeuten im
Vergleich zum konventionellen In-Gel Verdau äquivalent oder sogar
besser. Unabhängig vom verwendeten Verfahren, fehlten die
membranintegralen Peptide in den Spektren. Folglich wurde die
Detektierbarkeit und Signalintensität von tryptischen Peptiden in
Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren untersucht. Dabei ergab
sich eine direkte Korrelation zwischen der Proteinmenge einer Bande
und der Anzahl, der nach Verdau detektierten Peptide. Die
Untersuchungen an Peptiden aus löslichen und membranintegralen
Proteinen ergaben, dass die Hauptursache für das Fehlen letzterer,
nicht auf den Einfluss bestimmter AS auf die Ionisierbarkeit, die
Sequenzlänge und/oder die Hydrophobizität zurückzuführen war.
Entscheidend für die Abwesenheit der membranintegralen Peptide war
vielmehr die schlechte Zugänglichkeit der Schnittstellen für die
Protease, aufgrund unzureichender Denaturierung der
Sekundärstruktur bzw. der Aggregation hydrophober Abschnitte im
Rahmen der Probenaufarbeitung.