SUMOylierung

Die vorliegende Arbeit untersucht die Frage, ob humanes
CFTR-Protein (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator)
sumoyliert wird und welche funktionelle Bedeutung die Sumoylierung
des CFTRs hat. In der kaukasischen Bevölkerung gilt die Cystischen
Fibrose (CF) oder Mukoviszidose als eine der häufigsten
Erbkrankheiten. Mutationen im CFTR-Gen, die zu einer drastischen
Beeinträchtigung der Funktion des CFTR-Proteins führen, bilden die
molekulare Basis der Entstehung der CF. So sind häufig die Reifung
und der Transport von CFTR an die Plasmamembran betroffen. Diese
Prozesse und verschiedene Aktivitätszustände im CFTR werden u.a.
durch posttranslationale Modifikationen (z.B. Phosphorylierungen)
spezifischer Konsensus-Motive reguliert. In diesem Zusammenhang
führte eine genaue Betrachtung der Primärsequenz von CFTR zur
Identifikation von zwei hoch konservierten Motiven, die dem
publizierten SUMO-Konsensus-Motiv (ψKxE, nachfolgend SUMO-Motiv
genannt) an Position 447 und 1486, bezogen auf das zentrale Lysin,
an welchem die Sumoylierung stattfindet, entsprachen. Die
Sumoylierung, als eine Form der posttranslationale Modifikationen,
wird durch kleine Ubiquitin-ähnliche Proteine (small ubiquitin-like
modifier, SUMO) vermittelt. Diese stellen eine Klasse von
regulatorischen Proteinen dar, die die Aktivität des Zielproteins,
dessen Lokalisation oder die Interaktion mit anderen Proteinen
steuern. Damit ergab sich ein relevanter Anknüpfungspunkt, die
Rolle der bislang für die CFTR-Regulation noch nicht beschriebenen
Form der posttranslationalen Kontrolle durch Sumoylierung zu
untersuchen. Als Resultat der hier beschriebenen Untersuchungen
konnte die Sumoylierung als notwendiger Bestandteil der Regulation
des intrazellulären Transportes von CFTR identifiziert werden.
Konkret wurde mit dem Yeast-Two-Hybrid-Verfahren gezeigt, dass
CFTR-Domänen an den identifizierten SUMO-Motiven in der
Nukleotid-bindedomäne 1 (NBD-1) und am C-Terminus von CFTR
sumoyliert werden. Im Säugerzellsystem wurde die spezifische
Sumoylierung kompletten CFTRs durch transiente Transfektion von
CFTR- und SUMO-Expressionskonstrukten sowie in Zellen, welche CFTR
und SUMO endogen exprimieren, verifiziert. Verhindert man weiterhin
auf transiente Weise in Säugerzellen die Sumoylierung, durch
Mutation der beiden SUMO-Motive oder durch Überexpression der
SUMO-spezifischen Protease (SENP1), erreicht CFTR nicht die apikale
Plasmamembran. Im Gegensatz zu F508, welches im ER verbleibt, wird
CFTR, welches Mutationen in den SUMO-Motiven trägt, im
Golgi-Apparat zurückgehalten. Diese Beobachtung konnte mit Hilfe
der Dichtegradientenzentrifugation und anschließendem Nachweis der
Proteine in den entsprechenden Fraktionen über die
Western-Blot-Methode gezeigt werden. Abschließend wurden am
Beispiel eines zum SUMO-Motiv benachbart gelegenen
Di-Leucin-Motives erste experimentelle Hinweise erhalten, wonach
beide CFTR-Motive in der Interaktion mit dem für den vesikulären
Transport funktionell wichtigem Adaptor-Protein (AP) Komplex
zusammenwirken. Mit den vorliegenden Resultaten konnte erstmals die
Hypothese formuliert werden, dass die hier beschriebene
Sumoylierung eine Form der Modifikation ist, welche am Transport
von CFTR an die Plasmamembran maßgeblich beteiligt ist.