Die hyperosmotische Stressantwort von Escherichia coli-von der Proteomanalyse zu einzelnen Komponenten

Ein Habitat von Escherichia coli ist der Gastrointestinaltrakt von
Säugetieren, der sich durch anaerobe Bedingungen und eine hohe
Osmolalität auszeichnet. E. coli ist aber auch freilebend in
Gegenwart von Sauerstoff in der Umwelt bei variierenden
Osmolalitäten nachzuweisen. Eine Adaptation an diese ständig
wechselnden Umweltbedingungen ist entscheidend für Wachstum und
Überleben. In dieser Arbeit wurde der Adaptationsprozess an erhöhte
Osmolalitäten durch globale Proteomanalysen untersucht. Zusätzlich
wurden verschiedene Aspekte des Prozesses im Detail analysiert, um
weitere regulatorische Komponenten aufzudecken. Es wurden globale
Proteomveränderungen im pI-Bereich 4-7 nach osmotischem Stress
unter aeroben Bedingungen zeitabhängig visualisiert. Es konnte eine
verstärkte Produktion von 12 Proteinen nachgewiesen werden. 11
zusätzliche Proteine akkumulierten in Zellen, die einem osmotischen
Stress ausgesetzt waren, der durch Zugabe des Salzes NaCl ausgelöst
wurde. Der Großteil der durch Massenspektrometrie identifizierten
Proteine waren Proteine mit allgemeiner Schutzfunktion, die auf
transkriptioneller Ebene vom globalen Stressregulator RpoS
reguliert werden. Der Vergleich von aeroben und anaeroben
Bedingungen ergab eine Überlappung der akkumulierten Proteine von
50 %. Durch ergänzende Proteomanalysen mit alternativen Gelsystemen
konnten zwei weitere Proteine identifiziert werden, die an der
Osmostressantwort beteiligt sind. Die Zugabe des kompatiblen Soluts
Glycinbetain resultierte in einer verminderten Akkumulation von 9
RpoS-regulierten Proteinen bei Salzstress unter aeroben
Bedingungen. Für mindestens zwei Proteine konnte eine gegenläufige
Regulation nachgewiesen werden. Unter anaeroben Bedingungen
verminderte Glycinbetain die Akkumulation eines Proteins (ProX)
nach Zugabe von NaCl. Es wurden Proteomanalysen einer
K+-Aufnahmemutante im Vergleich zum Wildtyp bei hyperosmotischem
Stress erstellt, um den Einfluss der erhöhten intrazellulären
K+-Konzentration auf die nachfolgende Stressantwort zu untersuchen.
Es konnte gezeigt werden, dass die Regulation von zwei Proteinen
(ProX und TnaA) von der K+-Akkumulation abhängig ist. Das
Regulationsmuster weiterer Proteine, insbesondere metabolischer
Enzyme, war durch die fehlende Akkumulation von K+ in der Mutante
beeinflusst. Es wurde eine Methode entwickelt, um Veränderungen der
Proteininteraktionen direkt nach Salzstress aufzuzeigen. Durch
Fixierung der Zellen mit Formaldehyd und anschließender
Fraktionierung der Proteine konnten umfassende Veränderungen im
Interaktionsmuster periplasmatischer Proteine nachgewiesen werden.
Eine Bildung von Sauerstoffradikalen bei hyperosmotischem Stress
konnte unter Verwendung eines Fluoreszenzfarbstoffes erstmalig in
E. coli nachgewiesen werden. Die Inhibierung der Radikalbildung
durch Inkubation mit Natriumascorbat führte zu einer verminderten
Überlebenswahrscheinlichkeit der Zellen bei sehr hohen
NaCl-Konzentrationen. Zellen, die in Gegenwart von Natriumascorbat
einem Salzstress ausgesetzt waren, wiesen verminderte Mengen
bestimmter Osmostress-involvierter Proteine auf. Für E. coli
Stämme, denen Sauerstoffradikal-abbauende Enzyme wie Katalase und
Superoxiddismutase fehlten, wurde eine erhöhte Salzstressresistenz
gezeigt. Die phänotypische Analyse einer hdhA Mutante ergab
verminderte Wachstumsraten bei erhöhten Osmolalitäten. Die Mutante
war im Vergleich zum Wildtyp durch reduzierte Biofilmbildung und
Beweglichkeit sowie Veränderungen im Proteom nach hyperosmotischem
Stress gekennzeichnet. Die osmotisch induzierte, cytoplasmatische
Trehalase TreF reguliert die intrazelluläre Trehalosekonzentration
bei Salzstress unter aeroben Bedingungen. Unter anaeroben
Bedingungen konnten keine Unterschiede in den
Trehalosekonzentrationen in einer treF-Mutante im Vergleich zum
Wildtyp beobachtet werden. Die Zugabe des kompatiblen Solutes
Glycinbetain führte unabhängig von der Sauerstoffverfügbarkeit zur
verstärkten Produktion von TreF.