Untersuchungen zur Wechselbeziehung von Struktur und Funktion von Transkriptionsaktivatoren am PHO5-Promotor in Saccharomyces cerevisiae

Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Fragen zur Wechselbeziehung von Struktur
und Funktion von Transkriptionsaktivatoren am PHO5-Promotor in Saccharomyces
cerevisiae bearbeitet.
Im ersten Teil der Arbeit wurden zwei Deletionsmutanten des Transkriptionsfaktors
Pho4 hergestellt und charakterisiert. Dazu wurden aus der PHO4-Sequenz mit Hilfe
einer PCR-gestützten Methode jeweils die für die Aminosäuren 97 bis 106 sowie
101 bis 110 kodierenden Sequenzen entfernt. Mit Hilfe von geeigneten
Expressionsvektoren wurden beide Deletionsmutanten in S. cerevisiae exprimiert.
Das Ausmaß der Transkriptionsaktivierung durch die Konstrukte wurde durch
Messung der Aktivität der saueren Phosphatase bestimmt. Beide Mutanten
bewirkten eine deutliche Aktivierung der Transkription am PHO5-Promotor. Daraus
kann geschlossen werden, dass die hier deletierten Abschnitte von PHO4 keinen
wesentlichen Anteil an der Transkriptionsaktivierung durch Pho4 haben.
Zwischenzeitlich wurde der Nachweis einer minimalen transkriptionsaktivierenden
Domäne von Pho4 publiziert. Die minimale transaktivierende Domäne besteht aus
den Aminosäuren 79 bis 99. Dieser Abschnitt ist notwendig und ausreichend für die
Öffnung der Chromatinstruktur des Promotors und die Aktivierung der
Transkription. Die hier beschriebene Herstellung und Charakterisierung der
Deletionsmutanten von PHO4 leistete einen wesentlichen Beitrag zur Eingrenzung
der transaktivierenden Domäne von Pho4.
Der zweite Teil der Arbeit befasste sich mit der Wirkung des als GAGA-Faktor
(GAF) bezeichneten Transkriptionsfaktors aus Drosophila melanogaster am PHO5-Promotor
von S. cerevisiae. Dazu wurden chimäre Konstrukte aus dem GAF und der
DNA-bindende Domäne des Transkriptionsaktivators Pho4 hergestellt. Zudem
wurden auch Fusionskonstrukte mit jeweils nur einer Hälfte des GAF und der DNA-bindende
Domäne des Pho4 erzeugt. Diese Konstrukte wurden in S. cerevisiae
exprimiert. Hier zeigte sich, dass die Verbindung aus dem gesamten GAF und der
DNA-bindenden Domäne von Pho4, vermutlich aufgrund eines gestörten
intrazellulären Transports oder aufgrund einer Instabilität des Proteins, keine
Aktivität aufwies. Dagegen waren die Konstrukte, welche jeweils nur eine Hälfte
des GAF enthielten, in der Lage, eine Öffnung der Chromatinstruktur und eine
Aktivierung der Transkription am PHO5-Promotor zu bewirken.Um zu untersuchen, welche Veränderungen die chimären Konstrukte durch ihr Angreifen
am PHO5-Promotor an der Chromatinstruktur des Promotors verursachen, wurden
spezielle experimentelle Verfahren angewendet. Diese nutzen die unterschiedliche
Zugänglichkeit der DNA für Enzyme bei geöffneter oder geschlossener
Chromatinstruktur. Die Untersuchungen zeigten eine gleichartige Öffnung der
Chromatinstruktur am PHO5-Promotor durch beide Konstrukte. Die gleichartige
Öffnung der Chromatinstruktur korrelierte dabei nicht mit dem unterschiedlichen
Umfang der Transkriptionsaktivierung von PHO5. Aufgrund der fehlenden
Korrelation von Chromatinöffnung und Transkriptionsaktivierung stehen diese
Ergebnisse im deutlichen Widerspruch zu der von vielen Autoren vertretenen
Hypothese, der GAF würde die Transkription indirekt, nur durch die Öffnung
repressiver Chromatinstrukturen aktivieren (Derepression). Vielmehr weisen diese
Ergebnisse darauf hin, das der GAF auch als klassischer Transaktivator eine direkte
Aktivierung der Transkription bewirken kann. Die Aktivierung der Transkription
durch beide Hälften des GAF in den chimären Konstrukten war ein überraschendes
Ergebnis. Es zeigt, dass GAF neben der glutaminreichen Domäne eine weitere
Domäne enthält, die in vivo eine Aktivierung der Transkription bewirken kann.
Diese Erkenntnis ist grundsätzlich neu und in der Literatur bisher nicht beschrieben
worden.